Estudos ultraestruturais de células Vero-E6 infectadas com SARS-CoV-2 e tratadas com moléculas de ação antiviral

Abstract

Em dezembro de 2019, um novo coronavírus (SARS-CoV-2) foi identificado em Wuhan, China, e associado a uma infecção respiratória grave, hoje conhecida como COVID-19. Apesar do impacto na saúde pública mundial e de diferentes esforços, até o presente momento não há droga antiviral específica a ser utilizada. Nesse contexto, um sistema in vitro padronizado e bem caracterizado para produção de massa viral, para testes de candidatos à fármacos e vacinas contra o novo coronavírus é de extrema importância. Assim, este estudo objetivou: I) avaliar a susceptibilidade e permissividade das células de linhagem de rim de macaco verde africano (Vero-E6) para o SARS-CoV-2 e caracterizar o seu ciclo replicativo por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e de varredura de alta resolução (MEV); e II) verificar o impacto na biossíntese do vírus em células Vero-E6 mediante o tratamento com antivirais. Para isso, monocamadas de células Vero-E6 foram inoculadas com MOI (multiplicidade de infecção) 0,01 de SARS-CoV-2 e analisadas por MET e MEV para os estudos de susceptibilidade, permissividade e morfogênese. Para os estudos de inibição da biossíntese viral, as monocamadas infectadas foram tratadas com mefloquina e ao daclatasvir a 10 μM e, posteriormente, processadas por técnicas padrão para análises por MET. A partir do sobrenadante, o RNA viral foi quantificado por RT-qPCR e o título viral determinado por contagem de placas unidades formadoras de placa (PFU/mL). Diversas alterações ultraestruturais foram observadas nas células infectadas, incluindo intensa ativação celular evidenciada por filopódios, formação de sincícios, acúmulo de corpúsculos lipídicos, proliferação de vesículas de dupla membrana (VDM), degeneração de mitocôndrias, aumento no número de ribossomos elétron-densos e espessamento do retículo endoplasmático rugoso (RER). Com relação à biossíntese viral, observou-se internalização das partículas do SARS-CoV-2 majoritariamente por endocitose, parte da síntese viral ocorrendo no lúmen das VDMs e liberação da progênie viral por exocitose. O ensaio de qRT-PCR demonstrou aumento da progênie viral em log2 em 72 horas pós-infecção. Os estudos referentes ao objetivo II revelaram que a mefloquina a 10 μM promoveu inibição da replicação viral em 100%, enquanto o tratamento com daclatasvir inibiu em 80%, porém com este tratamento as células permanecem com viabilidade acima de 90%, enquanto com mefloquina esse número reduz para 9%. Os dados apresentados comprovam em nível ultraestrutural a susceptibilidade e a permissividade das células de linhagem Vero-E6 para o SARS-CoV-2 reforçando a utilização desta linhagem como um sistema in vitro para a produção de massa viral e testes pré-clínicos de drogas