Desenvolvimento e avaliação da técnica de amplificação mediada por circuito isotérmico (RT LAMP-PCR) para o diagnóstico molecular do mayaro vírus

Abstract

O vírus Mayaro (MAYV), agente etiológico da febre Mayaro, uma doença febril aguda clinicamente semelhante à febre Chikungunya, tem ocasionado pequenos surtos no Brasil. A incidência crescente em regiões não endêmicas é uma preocupação para a saúde pública, pois indica que o MAYV está se espalhando, podendo ocorrer futuras epidemias. Muitos casos de MAYV foram primeiramente diagnosticados como outros arbovírus, especialmente como CHIKV, devido à similaridade entre os sintomas e ocorrência de reatividade cruzada, o que pode levar à subnotificação da doença. Assim, o estabelecimento de métodos de diagnóstico mais específicos são de extrema importância para o controle dessa doença. Atualmente, o diagnóstico molecular de MAYV é realizado através da técnica de RT-PCR. Entretanto, o custo elevado, a necessidade de mão de obra especializada e de equipamentos sofisticados, limita a capacidade de diagnóstico em laboratórios com infraestrutura limitada. Neste trabalho, foi desenvolvida uma plataforma de transcriptase reversa seguida de amplificação isotérmica mediada por loop (RT-LAMP-PCR) para a detecção de MAYV em amostras humanas e de mosquitos. Os primers específicos para detecção de MAYV foram desenhados e sintetizados, e a técnica para detecção de MAYV foi padronizada. Os melhores resultados de amplificação foram obtidos a 70°C por 30 min de incubação. As concentrações ótimas de Mg2+, enzima Bst 3.0 e dNTPs foram 6 mM, 0,12 U/µL e 1,8 mM, respectivamente. Também foi observado que a reação não necessita de todos os primers para o desempenho, funcionando sem os primers do loop. O teste mostrou-se específico para detecção de MAYV quando testado frente a outros arbovírus e foi capaz de detectar o vírus em amostras humanas de soro, urina, saliva e em mosquitos experimentalmente infectados. Além disso, o teste foi até 1.000 vezes mais sensível e 29 vezes mais barato que a RT-qPCR para detecção de MAYV em amostras de soro.