Avaliação do papel funcional de IDO-1 e de seus metabólitos na imunopatogênese da Hanseníase

Abstract

Os metabólitos de triptofano e a Indoleamina 2,3 Dioxigenase-1 (IDO-1) estão envolvidos tanto em ambientes microbicidas quanto em ambientes tolerogênicos, e diversos trabalhos do nosso grupo demonstraram que essa enzima é diferencialmente regulada nas diferentes formas clínicas da hanseníase. Esse estudo teve como objetivo investigar avaliar o papel de IDO-1 e dos metabólitos do tiptofano na imunopatogênese da Hanseníase. Para isso, pacientes participantes do estudo foram recrutados no Ambulatório Souza Araújo (ASA) da Fiocruz e os buffy coats foram obtidos de doadores saudáveis pelo serviço de hemoterapia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), os monócitos foram obtidos a partir de células mononucelares derivadas de monócitos (PBMCs) por seleção positiva. Para diferenciar as mDCs, os monócitos foram estimulados com GM-CSF e IL-4 durante 6 dias. O fenótipo destas células e a expressão de IDO-1 foram avaliados por citometria de fluxo. A atividade de IDO-1 foi avaliada por HPLC e a produção de citocinas nos sobrenadantes foi determinada por ELISA. A imunofluorescência foi utilizada para as análises de expressão de IDO-1 e CD1a nas formas clínicas na hanseníase. O espectrofotômetro foi utlizado para a análise da concentração de NO (Óxido Nítrico) e atividade de Arginase-1 (Arg-1). A viabilidade de M. Leprae foi realizada utilizando a técnica de RT-PCR. Para um estudo mais robusto, paralelamente ao estímulo do M. leprae utilizamos as frações de membrana (MLMA) e solúvel (MLSA). O estimulo com M. leprae foi capaz de aumentar a expressão da proteína IDO-1 e sua atividade em mDCs. Entre os estímulos estudados, o MLMA induziu a produção de citocinas pró inflamatórias em mDCs, enquanto que MLSA induziu a produção de citocinas anti-inflamatórias. A ausência de TLR2 em culturas de mDCs levou a diminuição da atividade de IDO-1 induzida por M. leprae e MLMA, mostrando o envolvimento de TLR2 na indução de IDO-1. O bloqueio do TNF em mDCs estimuladas por M. leprae e suas frações levou a diminuição da atividade de IDO 1. Nossos dados demonstraram que a pré-incubação de mDCs com M. leprae induziu um aumento na frequência de células T reg CD4+CD25+FoxP3+ em culturas estimuladas com M. leprae e MLSA quando comparadas com as culturas não estimuladas, o que foi revertido na presença do inibidor de IDO-1, o 1 metil triptofano (1-MT). Foram observadas diferenças morfológicas e fenotípicas entre as mDCs de pacientes paucibacilares e multibacilares, a expressão e atividade de IDO-1 foi aumentada em pacientes multibacilares quando comparado aos paucibacilares, e a concentração de NO e atividade de Arg-1 foi aumentada em pacientes paucibacilares. Observou-se que os metabólitos 3-HAA e QUIN afetavam a viabilidade das mDCs, e também foi mostrado que IDO-1 e metabólitos do triptofano são importantes para a sobrevivência do bacilo. Além disso, esses metabólitos modularam a produção de CXCL-10, IL 10 e TNF. Em conjunto, nossos dados mostram que IDO-1 e os metabólitos do triptofano estão envolvidos na imunopatogênese da hanseníase, sendo capazes de mediar os mecanismos tolerogênicos observados na forma multibacilar e ao mesmo tempo mediar os mecanismos microbicidas observados na forma paucibacilar