Advisor | Menna-Barreto, Rubem Figueiredo Sadok | |
Author | Macedo, Isabela Silva | |
Access date | 2023-04-19T01:36:27Z | |
Available date | 2023-04-19T01:36:27Z | |
Document date | 2022 | |
Citation | MACEDO, Isabela Silva. Estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na liberação de armadilhas extracelulares neutrofílicas (NETs) em resposta a infecção in vitro por Toxoplasma gondii e seu papel no controle da carga parasitária. 2022. xv, 99 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) - Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2022. | en_US |
URI | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/57881 | |
Abstract in Portuguese | Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório presente no mundo todo, infectando de forma crônica cerca de um terço da população. A ação do sistema imune contra o parasito é essencial para impedir sua disseminação no organismo e evitar graves consequências. As armadilhas extracelulares neutrofílicas (NETs) formam um mecanismo de defesa mediada por neutrófilos que consiste no descondensamento da cromatina que, associada a histonas e peptídeos antimicrobianos, é liberada para o meio extracelular, aprisionando e matando patógenos. Atualmente se sabe que existe duas formas distintas de liberação de NET: rápida/vital e clássica/tardia. A NET rápida é liberada após poucos minutos de indução e mantêm a viabilidade do neutrófilo, permitindo a realização de outras funções, enquanto a NET clássica ocorre após algumas horas de indução, levando ao rompimento da membrana celular e consequente a morte do neutrófilo. Esse mecanismo foi demonstrado por neutrófilos de diversos hospedeiros intermediários e definitivo do T. gondii, porém o papel das NETs produzidas por neutrófilos humanos em resposta ao parasito e os mecanismos envolvidos no processo ainda necessitam de mais esclarecimento. Sendo assim, nosso objetivo com este trabalho foi caracterizar a produção de NET por neutrófilos humanos em resposta ao T. gondii e seu impacto no controle da carga parasitária. Neutrófilos humanos de indivíduos saudáveis foram incubados com taquizoítos da cepa RH (MOI 5:1) por 15 e 180 minutos, representando NET rápida e clássica, respectivamente. Após infecção, sobrenadantes foram coletados e DNA foi quantificado por PicoGreen. Em paralelo, células foram fixadas e processadas para microscopia de imunofluorescência e eletrônica de varredura (MEV). Ensaios de viabilidade e infectividade do parasito foram realizados após interação entre célula e parasito. Nossos resultados mostram que taquizoítos induzem a liberação de NET rápida e clássica por neutrófilos humanos, sendo essas compostas por DNA, histona H1 e mieloperoxidase, com a presença de vacúolos autofágicos, evidenciadas por microscopia de imunofluorescência. A interação analisada por MEV apontou dois fenótipos distintos das NETs nos tempos avaliados, ambos eficientes na associação com o parasito. Através de ensaio com inibidores farmacológicos confirmamos a participação de PAD4 e elastase neutrofílica para liberação de NET clássica e cálcio, ROS, PI3Kγ e PI3Kδ para NET rápida, sugerindo possível participação de autofagia. Por fim, demonstramos que apesar de aparentar aprisionar os parasitos, as NETs não afetam viabilidade e infectividade do mesmo. Em conjunto, estes dados contribuem com a compreensão de um mecanismo importante da imunidade inata no enfrentamento ao T. gondii | en_US |
Language | por | en_US |
Rights | open access | en_US |
Subject in Portuguese | Carga parasitária | en_US |
Subject in Portuguese | Mecanismos moleculares | en_US |
Subject in Portuguese | Videomicroscopia | en_US |
Subject in Portuguese | armadilhas extracelulares neutrofílicas | en_US |
Subject in Portuguese | Toxoplasma gondii | en_US |
Title | Estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na liberação de armadilhas extracelulares neutrofílicas (NETs) em resposta a infecção in vitro por Toxoplasma gondii e seu papel no controle da carga parasitária | en_US |
Type | Dissertation | en_US |
Defense date | 2022 | |
Departament | Instituto Oswaldo Cruz | en_US |
Defense Institution | Fundação Oswaldo Cruz | en_US |
Degree level | Mestrado Acadêmico | en_US |
Place of Defense | Rio de Janeiro | en_US |
Program | Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária | en_US |
Abstract | Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan present worldwide, chronically infecting about one third of the world’s population. The action of the immune system against the parasite is essential to prevent its dissemination through the organism and avoid serious consequences. Neutrophil extracellular traps (NETs) form a mechanism of defense mediated by neutrophils that consists of the decondensation of chromatin that, associated with histones and antimicrobial peptides, is released to the extracellular environment, entrapping and killing pathogens. Currently, it is known that there are two distinct forms of NET release: rapid/vital and classic/late. Rapid NET is released after a few minutes of induction and maintains neutrophil viability, allowing the performance of other functions, while classic NET occurs after a few hours of induction, resulting in cell membrane disruption and consequent neutrophil death. This mechanism has been demonstrated by neutrophils from several intermediate and definitive hosts of T. gondii, but the role of NETs produced by human neutrophils in response to the parasite and the mechanisms involved in the process still deserve further exploitation. Therefore, our objective with this work was to characterize the production of NET by human neutrophils in response T. gondii and its impact on parasite burden control. Human neutrophils from healthy subjects were incubated with tachyzoites of the RH strain (MOI 5:1) for 15 and 180 minutes, representing rapid and classic NET, respectively. After infection, supernatants were collected and DNA was quantified by PicoGreen. In parallel, cells were fixed and processed for immunofluorescence and scanning electron microscopy (SEM). Parasite viability and infectivity assays were performed after cell-parasite interaction. Our results show that tachyzoites induce rapid and classic NET release by human neutrophils, which are composed of DNA, histone H1 and myeloperoxidase, with the presence of autophagic vacuoles, evidenced by immunofluorescence microscopy. The interaction analysed by SEM showed two distinct phenotypes of the NETs in the evaluated times, both efficient in association with the parasite. Through assays with pharmacological inhibitors, we confirmed the participation of PAD4 and neutrophil elastase for the release of classic NET, and calcium, ROS and PI3K for rapid NET, suggesting possible participation of autophagy. Lastly, we demonstrated that despite appearing to entrap the parasites, NETs don’t affect their viability and infectivity. Together, these data contribute to the understanding of an important mechanism of innate immunity in the fight against T. gondii | en_US |
Affilliation | Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. | en_US |
Member of the board | Schmitz, Veronica | |
Member of the board | Matta, Renato da | |
Member of the board | Toledo, Karina | |
Member of the board | Saraiva, Elvira | |
Member of the board | Barbosa, Helene | |
DeCS | Carga Parasitária | en_US |
DeCS | Mecanismos Moleculares de Ação Farmacológica | en_US |
DeCS | Armadilhas Extracelulares | en_US |
DeCS | Toxoplasma | en_US |
DeCS | Microscopia de Vídeo | en_US |