Excisão do genoma proviral do HTLV-1 utilizando CRISPRCAS9 em linhagem celular da leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL)

Abstract

Introdução: O HTLV-1 foi o primeiro retrovírus humano descoberto em 1980, sendo associado a um linfoma incomum de células T, a ATLL. Mundialmente, a infecção pelo HTLV-1 acomete aproximadamente 20 milhões de pessoas. Cerca de 4% das pessoas infectadas desenvolvem ATLL. As formas mais agressivas apresentam um dos piores prognósticos entre os linfomas não Hodgkin, com baixa sobrevida associada (< 1 ano). Os tratamentos são baseados em poliquimioterapia, terapia antirretroviral, transplante de medula óssea e uso de terapia-alvo com anticorpos monoclonais. Apesar de reduzirem o agravamento da doença, eles não eliminam o HTLV- 1 do organismo infectado. Objetivo (s): Realizar um estudo de prova de princípio para avaliar se o sistema de edição genômica CRISPR-Cas9 é capaz de excisar o genoma proviral do HTLV-1 e eliminar seus efeitos indutores proliferativos na linhagem celular da ATLL, MT2. Material e Métodos: Estabelecimento da LTR, que flanqueia as extremidades 5' e 3' do genoma do HTLV-1, como região alvo para estratégia de edição, de forma que um RNA guia (gRNA) direcionando a enzima Cas-9 para a LTR promova um evento de clivagem dupla. Desenho de gRNAs para a LTR utilizando a ferramenta web CHOPCHOP e determinação dos gRNAs para controle positivo (sgRPL6) e negativo (sgAAVS1) da edição gênica. Utilização de um sistema de expressão lentiviral de segunda geração para entrega do complexo Cas9-gRNA às células alvo, MT2. Produção de partículas lentivirais recombinantes por lipofecção do sistema lentiviral em células HEK293T. Titulação das partículas para a transdução das MT2, com um MOI de 10, por espinoculação. Seleção das MT2 transduzidas com puromicina. A edição está sendo avaliada molecularmente pelo ensaio Surveyor (T7 endonuclease) e pelo sequenciamento de Sanger, a fim de caracterizar a região da cicatriz esperada pela clivagem da LTR. A capacidade infecciosa será analisada pela quantificação da carga proviral por qPCR. Resultados e Conclusão: As construções contendo os gRNAs propostos foram confirmadas por sequenciamento de Sanger. A concentração das partículas virais foi quantificada em aproximadamente 1x10^6 TU/mL. Os resultados preliminares da viabilidade das MT2 demonstraram a eficiência da transdução, verificada pela resistência à puromicina conferida às células. Através desse estudo, estão sendo desenvolvidos a base e o conhecimento necessários para futuros ensaios clínicos, abrindo perspectivas para interromper a oncogênese associada ao HTLV-1.