Manipulação gênica em tripanossomatídeos: uso de diferentes ferramentas moleculares para desvendar alvos para quimioterapia

Abstract

O presente trabalho teve como foco obtenção de Trypanosoma cruzi e Leishmania spp. geneticamente modificados com objetivo de contribuir com o entendimento de vias metabólicas relacionadas à resistência aos medicamentos de uso clínico e para identificar alvos promissores para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da doença de Chagas e das leishmanioses. Empregamos diferentes metodologias de manipulação gênica: substituição alélica por recombinação homóloga, deleção por CRISPR/Cas9, expressão de proteínas heterólogas e indução da expressão por tetraciclina. O trabalho foi dividido em três capítulos de temáticas independentes. No primeiro capítulo demonstramos de forma inédita a deleção do gene multicópias prostaglandina F2alfa sintase (PGFS) em T. cruzi usando o CRISPR/Cas9. A PGFS tem sido relacionada com os mecanismos de resistência a fármacos em T. cruzi, mas o mecanismo pelo qual a resistência é gerada ainda não foi completamente elucidado. Aqui demonstramos que a deleção da PGFS não alterou a susceptibilidade dos parasitos ao benzonidazol e ao nifurtimox, provavelmente devido ao aumento da expressão da nitrorreductase NTR-1. Por outro lado, a deleção tornou os parasitos menos tolerantes ao estresse oxidativo e menos infectivos. No segundo capítulo mostramos que não foi possível deletar a enzima ferro superóxido dismutase A (FeSOD-A) em L. infantum, uma importante enzima da defesa antioxidante, o que parece indicar a essencialidade da enzima para os parasitos. Apesar da incapacidade de se obter parasitos nocautes para FeSOD-A, foi demonstrado que parasitos com diminuição da expressão dessa enzima são mais resistentes ao antimônio e à miltefosina, o que parece ter sido causado por um aumento da expressão da ascorbato peroxidase (APX) e outras FeSODs. Esses parasitos também são mais susceptíveis ao estresse oxidativo e apresentaram menor infectividade em células THP-1 que os parasitos selvagens. Considerando que os potenciais alvos na busca de novos fármacos são genes importantes para sobrevivência dos parasitos e, portanto, genes essenciais (como por exemplo, a FeSOD-A), no terceiro capítulo desse trabalho apresentamos um novo sistema induzível para Leishmania, a fim de contribuir com o estudo de genes essenciais. O ineditismo do estudo está na integração das unidades induzíveis em regiões subteloméricas, o que permitiu obter uma regulação fina da expressão gênica. Por meio dessa estratégia obtivemos níveis baixos ou nulos de expressão com o sistema desligado, o que indica o caráter promissor do sistema aqui desenvolvido, já que essa era uma limitação importante dos trabalhos anteriores