Avaliação da atividade antifúngica e antibiofilme de cepas fúngicas do bioma amazônico frente Sporothrix brasiliensis

Abstract

A esporotricose, uma doença tropical negligenciada emergente causada por Sporothrix brasiliensis, afeta humanos e animais por transmissão zoonótica, epizoótica e ambiental. O aumento dos casos no Amazonas, aliado à resistência antimicrobiana, reforça a necessidade de novas estratégias de controle. Neste contexto, este estudo utilizou a abordagem “One Strain, Many Compounds” (OSMAC) visando a produção de compostos bioativos de microrganismos do bioma amazônico como alternativa antifúngica. Foram investigadas quinze espécies fúngicas da Coleção de Fungos da Amazônia (CFAM), pertencentes aos gêneros Clonostachys, Penicillium, Purpureocillium e Trichoderma, destacadas pelo seu potencial biotecnológico em estudos antifúngicos. Ensaios de cultura pareada foram realizados para selecionar a espécie com maior inibição do crescimento micelial (PIRG). As espécies T. atroviride, T. asperellum, T. tawa, T. harzianum e T. gamsii apresentaram melhores resultados, com inibição do crescimento micelial entre 35% e 36%, demonstrando controle biológico do tipo micoparasita com supercrescimento. Ensaios de microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelaram que o mecanismo de ação micoparasítico das espécies de Trichoderma envolviam hiperparasitismo, com enrolamento e crescimento paralelos de hifas sobre o patógeno S. brasiliensis. Em contrapartida, houve uma ação antagonista em resposta ao parasitismo por espécies de Trichoderma. Os extratos das cinco espécies do gênero Trichoderma foram obtidos a partir do cultivo líquido em meio BDL por sete dias, sob agitação rotativa com aeração a 28ºC e a 100 rpm, em seguida realizou-se a partição líquido-líquido com acetato de etila e a submersão do micélio em metanol, resultando na obtenção de dez extratos para a avaliação. A atividade antifúngica in vitro foi analisada contra S. brasiliensis nas formas leveduriforme e filamentosa e para a cepa clínica de S. brasiliensis, que incluem a determinação das concentrações inibitória mínima (CIM) e fungicida mínima (CFM). Os extratos em acetato de etila exibiram maior eficácia antifúngica geral. O extrato de T. tawa destacou-se com CIM e CFM de 6,25 mg/mL para ambas as formas morfológicas de S. brasiliensis, enquanto T. atroviride apresentou CIM e CFM de 12,5 mg/mL. Em comparação, T. asperellum demonstrou variação conforme a morfologia, com CIM e CFM de 12,5 mg/mL para a forma filamentosa e 25 mg/mL para a leveduriforme. T. gamsii e T. harzianum necessitaram de concentrações mais altas para inibir o crescimento. No ensaio de susceptibilidade com antifúngico itraconazol constatou-se que a cepa clínica de S. brasiliensis é resistente itraconazol com CIM e CFM de 10 mg/mL. Em seguida, ensaios de viabilidade e citotoxicidade em células renais de macaco verde africano (VERO) mostraram que os extratos metanólicos de T. asperellum e T. gamsii apresentaram menor citotoxicidade, enquanto os extratos de acetato de etila de T. tawa e T. harzianum foram moderadamente citotóxicos. No ensaio de inibição do biofilme nos tempos de 24 horas, 72 horas e 120 horas, os extratos de acetato de etila de T. asperellum e T. tawa apresentaram ação rápida e eficaz, com reduções acima de 96% em baixas concentrações. Já os extratos metanólicos de T. asperellum e T. harzianum apresentaram ação sustentada contra biofilmes maduros, com reduções superiores a 97% na forma filamentosa. A análise por MEV e Microscopia óptica confocal de fluorescência (MOFC), com os extratos de acetato de etila, foram constatadas alterações significativas na matriz extracelular do biofilme, incluindo danos citoplasmáticos, redução da aderência celular e possível impedimento de germinação para ambas as formas dimórficas de S. brasiliensis. Os resultados deste estudo indicam que os extratos de Trichoderma, especialmente de T. asperellum e T. tawa, são candidatos promissores para o desenvolvimento de terapias antifúngicas e antibiofilme. Sugere-se, como estratégia futura, a combinação de extratos de acetato de etila e metanol para potencializar a eficácia antifúngica e antibiofilme. Além disso, a caracterização química dos extratos é essencial para correlacionar os compostos ativos com a atividade observada frente S. brasiliensis.