Desenvolvimento de um antígeno recombinante F1 de Yersinia pestis para o diagnóstico sorológico multi-espécie da peste bubônica

Abstract

A peste é uma zoonose transmitida por pulgas que afeta uma ampla gama de mamíferos e tem como agente causador a bactéria gram-negativa Yersinia pestis. No Brasil, a peste persiste em focos naturais localizados nos estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Bahia, Minas Gerais e Rio de Janeiro, sendo necessária uma vigilância epidemiológica permanente para evitar a ocorrência de novos casos humanos. O diagnóstico de rotina é realizado pela identificação de anticorpos contra o principal antígeno desta bactéria que é o antígeno F1. através da técnica de Hemaglutinação (HA) porém, este tipo de ensaio apresenta uma interpretação subjetiva, reação cruzada com outros patógenos, exige grandes quantidades do antígeno F1 obtidas da Y. pestis (F1 nativa) e suprimentos imunobiológicos de difícil disponibilidade. A produção da proteína F1 demanda grandes quantidades de cultura de Y.pestis, considerando a classe de risco deste patógeno, essas devem ser manipuladas em laboratório de Nível de Biossegurança-3 (NB-3). Visando contornar estas dificuldades, nosso grupo de pesquisa desenvolveu em Escherichia coli uma primeira proteína F1 recombinante (F1-rec), que em ensaios de HA, funcionou de forma similar a F1 nativa. No entanto, a proteína F1-rec apresentou duas isoformas devido a presença do peptídeo sinal. Assim, este projeto teve como proposta desenvolver uma nova recombinante F1 (F1-rec2), na qual o gene caf1 teve a região codificante para o peptídeo sinal retirado, além da otimização dos códons para expressão em E. coli. Em seguida, essa construção foi transformada em diferentes linhagens de Escherichia coli e a expressão da proteína em F1-rec2 foi realizada em diferentes condições de temperatura e densidade óptica bacteriana. A expressão da proteína F1-rec2 foi confirmada pela visualização da proteína em gel SDS-PAGE 20%, e por ensaio de western blot utilizando anticorpos monoclonais anti-His. Em seguida, foi realizada a produção em larga escala da proteína F1-rec2 e sua purificação por cromatografia de afinidade que apresentou rendimento médio 19,2 mg/L em duas purificações distintas. Por fim, de forma preliminar o antígeno F1-rec2 foi avaliado quanto a sua imunorreatividade via ensaio de ELISA multi-espécie. Os resultados obtidos demonstram que a proteína F1-rec2 é capaz de diferenciar entre soros IgG positivos e negativos para a peste, assim como a proteína F1 nativa em menores concentrações de antígeno. Desta forma, conclui-se que a proteína F1-rec2 apresenta grande potencial para ser utilizada para o diagnóstico sorológico da da peste no Brasil.