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OS SÍTIOS ADICIONAIS DE TRANS-SPLICING NA 5' UTR DOS GENES TRANS-SIALIDASE DE TRYPANOSOMA CRUZI E AVALIAÇÃO DE SEUS EFEITOS SOBRE A TRADUÇÃO
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Abstract in Portuguese
A regulação gênica em tripanossomatídeos é policistrônica e ocorre de maneira pós-transcricional. Nas extremidades 5' e 3' dos RNA mensageiros existem segmentos que podem conter elementos regulatórios chamados UTR (Untranslated Regions), os quais são regiões transcritas, porém não-traduzidas. Para verificar se UTR de tamanhos diferentes possuem impacto na transcrição e, por conseguinte, na tradução de proteínas, selecionou-se genes da família de trans-sialidases, devido à importância destas no processo de invasão celular. A metodologia envolveu a extração de RNA total de T. cruzi CL-Brener, seguido da síntese de cDNA, PCR, clonagem dos produtos amplificados e seqüenciamento por Sanger e pelo uso do 454 Junior (Next Generation Sequencing \2013 NSG). Como as trans-sialidases correspondem a uma família gênica de cópias múltiplas, usou-se a estratégia de sequenciamento de alto-desempenho na tentativa de cobrir o maior número possível de genes desta família. Para isso foram obtidos cDNAs de trans-sialidases de CL-Brener nas formas epimastigota e tripomastigota com o iniciador 5\2019UTRTCNA, os quais apresentaram UTR com tamanhos variados entre 65 \2013 187 pb, além da obtenção de cDNAs para esta família de proteínas, em epimastigotas CL-Brener, com o iniciador 5\2019TcTS, apresentando UTR variando de 171 a 221 pb, com similaridade de sequências entre elas. Com o intuito de avaliar a correspondência entre a transcrição dos RNAs de trans-sialidases e a sua tradução, houve a necessidade de identificação das proteínas. Desenvolvemos uma metodologia de lise celular e produção de extrato proteico (denominado TcS12) a partir de células de T. cruzi no estágio epimastigota. As cepas selecionadas para esse estudo foram CL-Brener (TcVI), Dm28c (TcI), Y (TcII) e 4167 (TcIV)
O processo de lise celular foi otimizado para 107 parasitos/mL ressuspensos em 200 \03BCL de tampão de lise hipotônica (por 30 minutos a 40C), associado ao sonicador de banho (por 30 minutos a 40C). A eficiência da metodologia foi validada pela citometria de fluxo mostrando que aproximadamente 72% das células foram marcadas com iodeto de propídeo (PI). A qualidade dos extratos proteicos foi analisada por LCMS/MS usando-se a estratégia MSE label free para quantificação relativa de proteínas. Foram identificadas 1153 proteínas totais, cuja expressão proteica das cepas 4167, Dm28c e Y, quando comparada à CL-Brener (cepa referência), apresentou 32, 51 e 73 proteínas up-expressed, enquanto que 80, 92 e 60 proteínas mostraram-se down\2013expressed, respectivamente. Entre as trans-sialidases identificadas, a única cópia encontrada no extrato TcS12 (número de acesso no UniProt - Q4DGV8) apresentou seu RNAm correspondente no banco de dados de cDNA de CL-Brener, com UTR de 214 pb, estando, portanto, na faixa de tamanhos das outras UTR de trans-sialidases obtidas neste estudo. Esse resultado sugere que outros fatores, não necessariamente o tamanho per se das UTR, podem influenciar no fenômeno de tradução nesses tripanossomatídeos. Em relação aos extratos proteicos de epimastigotas gerados a partir das outras cepas, a quantidade de trans-sialidases identificadas foram de 1 (cepa 4167), 2 (cepa Dm28c) e 117 (cepa Y) cópias, indicando assim a tradução satisfatória de pelo menos uma das muitas cópias desta família gênica
Abstract
Gene regulation in trypanosomatids is polycistronic and occurs in a post - transcriptional way. There are also regulatory elements named UTRs (Untranslated Regions) that are transcribed regions, but not translated. To verify the impact of UTRs presenting different sizes in the transcription machinery and protein translation, genes from trans-sialidase family were selected due to its importance in the cell invasion process. The methodological strategies involved the extraction of total RNA from T. cruzi CL – Brener strain, followed by cDNA synthesis, PCR, cloning and sequencing of amplified products by Sanger and by using the 454 Junior (Next Generation Sequencing – NGS). Considering that trans-sialidase is a multi – copy gene family, this high – throughput sequencing strategy was employed in an attempt to cover the largest number of trans-sialidase genes. Trans – sialidase cDNAs from CL-Brener epimastigote and tripomastigote were obtained with 5’UTRTCNA primer showing UTR sizes between 65-187 bp. The cDNA from this protein family were also obtained with the 5’TcTS primer from CL-Brener epimastigotes, generating UTRs with 171-221 bp. Both 5’UTR presented sequence similarities between them. In order to evaluate the correspondence between trans-sialidase gene transcription and translation, it was necessary to accomplish the identification of proteins. Therefore, we developed a methodology for cell disruption, which resulted in a protein extract (referred as TcS12) from epimastigote T. cruzi cells. The strains selected for this study were CL-Brener (TcVI), Dm28c (TcI), Y (TcII) and 4167 (TcIV). The process for lysing the cells was optimized to 107 parasites/mL resuspended in 200 μL hypotonic lysis buffer (30 minutes at 4 ℃), followed by water bath sonication (30 minutes at 4 ℃). The process efficacy was confirmed by FACS, showing that near 72% of the cells were successfully stained with propidium iodide solution (PI). The quality of the protein extracts was analyzed by LCMS/MS using the strategy MSE label free for relative quantification of proteins. A totality of 1153 proteins were identified and the comparison of the expression profiles between the strains 4167, Dm28c and Y, using the CL-Brener as reference, showed 32, 51 and 73 proteins up - expressed, and 80, 92 and 60 proteins were shown to be down-expressed, respectively. We observed that 117 trans-sialidases were identified in Y strain, whilst in 4167, Dm28c and CL-Brener were found 1, 2 and 1 trans-sialidases, respectively. Moreover only one copy of trans-sialidase found in the TcS12 extract (UniProtaccession number-Q4DGV8), also met its corresponding mRNA in the CL-Brener cDNA database, presenting an UTR of 214 bp, in the size range of the others trans-sialidase UTRs obtained herein. This result suggests that other factors, but not exclusively the UTR sizes per se, could be related to the translation phenomenon in these trypanosomes.
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