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Title: Caracterização do ambiente genético dos genes de resistência a \03B2-lactâmicos e aminoglicosídeos, blaSPM-1 e rmtD, em amostras de Pseudomonas aeruginosa pertencentes ao clone ST277, epidêmico no Brasil
Advisor: Assef, Ana Paula D'Alincourt Carvalho
Members of the board: Galvão, Teca Calcagno
Albano, Rodolpho Mattos
Leão, Robson de Souza
Dávila, Alberto Martín Rivera
Marques, Elizabeth de Andrade
Authors: Silveira, Melise Chaves
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: O surgimento de bactérias Gram-negativas resistentes à drogas tem sido progressivo e alarmante. Entre os patógenos de particular importância está Pseudomonas aeruginosa multirresistentes à drogas (MDR). Um clone epidêmico de P. aeruginosa MDR produtor da metalo-\03B2-lactamase SPM-1, chamado clone SP (ST277), tem sido encontrado em diferentes estados brasileiros. O gene blaSPM-1 foi descrito em uma estrutura genética chamada ISCR4, responsável pela sua mobilização e expressão. Além do gene blaSPM-1, tem sido descrito, neste clone, a presença de um integron de classe I carreando genes de resistência (In163) e um elemento genético ISCR14 carreando uma metilase de RNAr 16S (rmtD), que confere resistência a altas concentrações de aminoglicosídeos. Este tipo de associação resulta em um perfil de resistência extremamente preocupante. Assim, este estudo teve como objetivo investigar a contexto genético dos genes blaSPM-1 e rmtD, além de caracterizar mutações em genes cromossomais associados a multirresistência a antimicrobianos em amostras de P. aeruginosa pertencentes ao clone ST277, através de Sourthen blot e sequenciamento de nova geração. A partir de 50 amostras de P. aeruginosa MDR isoladas entre 2007 e 2010, foram selecionadas 13 amostras pertencentes ao ST277 (através de MLST) que apresentaram positividade para blaSPM-1 e/ou rmtD e In163 (através de PCR), sendo 12 do clone SP (A) e uma de um clone diferente, M, através de PFGE. Através de restrição do DNA com as enzimas de restrição SpeI e XbaI, e posterior hibridação com sondas dos genes alvos (blaSPM-1, rmtD e In163) foi possível observar que os genes alvos encontravam-se em fragmentos distintos e que a amostra do clone M apresentou um perfil de hibridação diferentes das demais amostras demonstrando a ocorrência de vários rearranjos na mesma, indicando uma maior distância evolutiva A partir destes resultados, selecionamos 6 amostras para sequenciamento total do genoma utilizando a plataforma de sequenciamento MiSeq da Illumina. Através de sucessivas análises - que incluíram os contigs gerados na montagem de novo, montagens por referência e alinhamentos par a par- chegamos a uma região de 239.648pb onde estavam contidos o In163 e o ISCR14 carreando rmtD, inseridos em uma ilha genômica incorporada ao cromossomo bacteriano. O gene blaSPM-1 inserido no ISCR4 foi encontrado em uma região de 13.959pb, que incluía genes relacionados a plasmídios e transposons, contudo ainda não sabemos se esse elemento está incorporado ao cromossomo, ou livre em forma de plasmídio. Através da análise das mutações em genes cromossômicos associados a resistência à antimicrobianos, encontramos mutações nos genes oprD, ampD, mexZ, mexS, mexT, gyrA e parC que foram comuns às 6 amostras sequenciadas do ST277. Isso explicaria o fenótipo MDR nas amostras negativas para rmtD e/ou blaSPM-1. Além disso, como estas amostras foram isoladas em estados e anos distintos, acreditamos que essas mutações sejam características do ST277, o que pode ser um dos fatores associados a distribuição epidêmica deste clone no Brasil
Abstract: The development of antimicrobial resistance among Gram - negative pathogens has been progressive and relentless. A pathogen of particular concern is multidrug - resistant (MDR) Pseudomonas aeruginosa . An epidemic clone of MDR P. aeruginosa producing the metall o - β - lactamase SPM - 1, named SP clone (ST277), has been found in different Brazilian states. The bla SPM - 1 gene has been described in a genetic structure called ISCR4, responsible for its mobilization and expression. Besides the bla SPM - 1 gene, it has been des cribed in this clone, a classe I integron (In163) carrying resistance genes and the genetic element ISCR14 carrying a 16S rRNA metilase ( rmtD ), that confers resistance to high concentrations of aminoglycosides. This kind of association results in an extrem ely worrisome profile of resistance. Thus, this work aimed to investigate the genetic background of bla SPM - 1 and rmtD genes and to characterize mutations in chromosomal genes associated with multidrug resistance in P. aeruginosa isolates belonging to ST277 clone, using Sourthen blot and next - generation sequencing. From 50 MDR P. aeruginosa isolates recovered from 2007 to 2010,there were selected 13 bla SPM - 1 and /or rmtD - positive isolates (by PCR) belonging to ST277 (by MLST), 12 f rom SP (A) clone and one from a different PFGE clone (M). By DNA digestion with Spe I and Xba I restriction enzymes, and subsequent hybridization with probes for target genes ( bla SPM - 1 , rmtD and In163 ), it was observed that the target genes were in separate fragments, and that the M clone isolate showed a different profile compared with the other isolates, indicating various rearrangements, suggesting a greater evolutionary distance. With these results, 6 isolates were selected for whole genome sequencing by Illumina MiSeq platform. Through successive analyzes – which included de novo assembly contigs, map to reference assemblies and pairwise alignments - we came up to a 239648pb region containing the In163 and ISCR14 inserted into a genomic island incorporated into bacterial chromosome. The bla SPM - 1 gene was inserted into ISCR4, found in a 13950pb region, which included genes related to plasmids and transposons, however we do not know whether this element s chromosomal or plasmidial . Through analysis of chromoso mal genes mutations associated with multidrug resistance, we found mutations in oprD, ampD, mexZ, mexS, mexT, gyrA e parC genes, which were common to the 6 ST277 isolates sequenced. This would explain the MDR phenotype in bla SPM - 1 and/or rmtD negative isol ates. Furthermore, since these microorganisms were isolated in different years and states, we believe these mutations are ST277 characteristic, which may be one of the factors associated with the epidemic characteristics of this clone
DeCS: Pseudomonas aeruginosa
Células Clonais
Genômica
Genes MDR
Issue Date: 2014
Citation: SILVEIRA, Melise Chaves. Caracterização do ambiente genético dos genes de resistência a β-lactâmicos e aminoglicosídeos, blaSPM-1 e rmtD, em amostras de Pseudomonas aeruginosa pertencentes ao clone ST277, epidêmico no Brasil. 2014. 99f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2014.
Date of defense: 2014
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Dissertações de Mestrado

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