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Title: Diferenças na expressão gênica e na forma de direcionamento da região COOH-terminal de císteina-proteinase B de Leishmania (Leishmania) amazonensis
Advisor: Alves, Carlos Roberto
Members of the board: Leon, Leonor Laura
Faria, Suzana Corte Real
Madeira, Maria de Fátima
Santos, Eduardo Caio Torres dos
López, Raquel Elisa da Silva
Authors: Souza, Raquel Santos de
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: A Leishmania (Leishmania) amazonensis apresenta mecanismos de adaptação guiados por suas proteinases. Neste contexto, destacam-se as cisteína proteinases (CPs) onde a cisteína proteinase B (CPB) é a CP mais estudada dentre as CPs deste parasito. O foco deste trabalho é a região COOH-terminal da CPB (cyspep), gerada a partir do processamento final desta proteinase. O estudo foi conduzido em cinco fases: obtenção da cyspep recombinante (rcyspep); avaliação da antigenicidade da rcyspep em camundongos experimentalmente infectados com L.(L.) amazonensis; diferenciação in vitro dos promastigotas em amastigotas; avaliação da expressão do gene cpb ao longo da diferenciação do parasito; e detecção da cyspep nas formas promastigotas e amastigotas do parasito. O polipeptídeo rcyspep, de 14 kDa, foi obtida em sistema pET28-a e purificado para posterior produção de anticorpos policlonais específicos em camundongos. Observou-se que, durante a infecção em camundongos, há uma resposta imune humoral contra o rcyspep, caracterizada por um aumento da detecção de anti-cyspep quando comparado com animais de controle (p <0,05). Nos ensaios de diferenciação constatamos três padrões morfológicos ao logo de 96 horas de análise, em uma cinética temporal: formas alongadas com flagelo livre, arredondados com flagelo e arredondadas sem flagelo por microscopia. Adicionalmente a cultura foi analisada por citometria de fluxo demonstrando uma migração gradual da população da região R1 para região R2 do dotplot indicando uma diminuição no tamanho e aumento da granulosidade celular. Observamos que ao longo desta diferenciação ocorre um aumento da quantidade de transcritos do gene cpb, nos tempos de 48 horas (1,3 ×), 72 horas (3,2 ×) e 96 horas (3,4 ×) nas preparações de cDNA dos parasitos, quando comparada com os resultados de quantificação realizados com preparações de cDNA dos promastigotas Na continuidade deste trabalho, o anti-rcyspep foi utilizado como ferramenta nos estudos de detecção da proteína em preparações de promastigotas e amastigotas obtidas por fracionamento subcelular e no sobrenadante de cultivo por ensaios de ressonância plasmônica de superfície. Os sensorgramas obtidos nestes ensaios revelaram valores de RU de dissociação, indicativos do reconhecimento do anti-rcyspep em todas as preparações do parasito. Constatamos que as proteínas das preparações de membrana e flagelo de ambas as formas têm menor propriedade de ligar a IgG anti-rcyspep. Dentre estas, as preparações de proteína de membrana de amastigota apresentaram os menores valores de Ksat. Por outro lado, os sobrenadantes de cultivo dos promastigotas e amastigotas apresentaram menores quantidades de proteínas reagentes a IgG anti-rcyspep. Adicionalmente, constatamos que as proteínas do parasito reconhecidas pela IgG anti-rcyspep que ligam ao E-64 foram melhor detectadas nas preparações de sobrenadante de cultura de promastigotas (1,4 x 10-2 ng/mm2). O conjunto dos resultados deste trabalho indica que amastigotas de L. (L.) amazonensis apresentam maior expressão de gene cpb do que promastigota e que ambas as formas lançam o polipeptídio cyspep para o meio extracelular, porém apenas os promastigotas lançam este polipeptídio ainda associada à enzima CPB
Abstract: Leishmania (Leishmania) amazonensis presents adaptive me chanisms guided by their proteinases. In this context, we highlight the cysteine proteinases (CPs) where the cysteine proteinase B (CPB) is the most studied CP among these parasites. The focus of this work is the COOH - terminal region of CPB (cyspep), gener ated during the final processing stage of this proteinase. Our study comprises five main phases: obtaining of a recombinant cyspep polypeptide (rcyspep); evaluation of the antigenicity of rcyspep in mice experimentally infected with L. (L.) amazonensis ; in vitro differentiation of promastigotes into amastigotes; evaluation of cpb gene expression throughout morphological differentiation of the parasite; and detection of cyspep in promastigotes and amastigotes of L. (L.) amazonensis. The rcyspep polypeptide, with 14 kDa, was obtained using a pET28 - a system and, subsequently, specific polyclonal antibodies were produced by inoculation in mice. We observed that, during mice infection, there is a humoral immune response against rcyspep, characterized by an increa se in detection of anti - cyspep when compared to control animals (p<0.05). During differentiation assays three morphological patterns could be observed over 96 hours of observation: elongated shapes with free flagellum, rounded shapes with free flagellum an d rounded shapes without visible flagellum. The data point to a gradual migration of the population of parasites from region R1 to r egion R2 into the dotplot indicating a decrease in size and increase in cell granularity. We observed that alongside the mor phological differentiation there is an increase in the amount of cpb gene transcripts, in time of 48 hours (1.3 ×), 72 hours (3.2 ×) and 96 hours (× 3.4), compared with quantitation results obtained with cDNA of promastigotes. Purified anti - rcyspep IgGs we re lately used as a tool to detect cyspep in subcellular fractions and culture supernatants of promastigote and amastigote by surface plasmon resonance assays. The sensorgram obtained from these assays indicate RU dissociation values that detect the recogn ition of anti - parasite rcyspep in all preparations. We noticed that membrane and flagellum protein extracts of both parasite forms present lower capacity to interact with anti - rcyspep IgG. The interaction coefficients of each sample with anti - rcyspep IgG w ere analyzed and we could observe that amastigote membrane protein preparations have lower Ksat values. Comparatively, the culture supernatants of amastigotes and promastigotes exhibited lower p roportions of rcyspep anti - IgG - binding proteins. Additionally, we found that parasite proteins were recognized by anti - IgG rcyspep that bind to E - 64 were best detected in promastigote culture supernatant preparations, 1.4 x 10 - 2 ng/mm2 on the chip. Collectively the results indicate that amastigotes of L. (L.) amazone nsis exhibit hi gher expression of cpb gene that promastigote and that both forms releases the polypeptide cyspep to the extracellular environment, but only promastigotes releases that polypeptide still associated with CPB enzyme
DeCS: Leishmania
Fracionamento Celular
Ressonância de Plasmônio de Superfície
Cisteína Proteases
Issue Date: 2015
Citation: SOUZA, R. S de. Diferenças na expressão gênica e na forma de direcionamento da região COOH-terminal de císteina - proteinase B de Leishmania (Leishmania) amazonensis. 2015.104f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2015
Date of defense: 2015-05-19
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBP - Dissertações de Mestrado

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