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Title: Trypanosoma cruzicontribuição ao estudo da endocitose dependente e independente de clatrina em formas epimastigotas
Advisor: Soares, Maurilio José
Members of the board: Pons, Andréa Henriques
Figueiredo, Regina Célia Bressan Queiróz de
Silva, Narcisa Leal Cunha e
Faria, Suzana Corte Real
Castro, Solange Lisboa de
Authors: Corrêa, José Raimundo
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: Endocitose em células eucarióticas é o processo de internalização de macromoléculas por diferentes vias, com diversas proteínas associadas, através do brotamento de vesículas na membrana plasmática e endereçamento destas vesículas a compartimentos endosomais no citoplasma. Os tripanosomatídeos são protozoários flagelados patogênicos de grande importância médica e veterinária que apresentam diferentes formas adaptativas ao longo de seu ciclo de vida. Estes parasitas estão estruturalmente organizados dentro de um arcabouço de microtúbulos subpeliculares, o que dificulta invaginações de membrana na maior parte do corpo celular. Entretanto, este arcabouço é descontinuado na região da bolsa flagelar, de onde o flagelo emerge do corpo. Formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi apresentam além da bolsa flagelar uma segunda invaginação de membrana, o citóstoma/citofaringe, uma estrutura sustentada por microtúbulos especializados que participa ativamente no processo de endocitose. Esta tese teve por objetivo investigar as vias endocíticas presentes nos dois sítios competentes para a captação de nutrientes (bolsa flagelar e citóstoma) de epimastigotas de T. cruzi. Após incubação dos parasitas a 4oC ou 28oC com albumina, transferrina e LDL conjugadas a ouro coloidal e posterior processamento para microscopia eletrônica de transmissão (MET), foram observadas vesículas endocíticas revestidas brotando da bolsa flagelar. Análise do conteúdo protéico dos protozoários detectou a expressão de clatrina, confirmada por citometria de fluxo e análise in silico da base de dados genômicos do T. cruzi. Por microscopia confocal localizou-se a expressão de clatrina na bolsa flagelar dos parasitas... (...) Como transferrina foi visualizada em vesículas sem revestimento localizadas majoritariamente no citóstoma, frações de membrana detergente-resistentes foram purificadas por fracionamento celular e o conteúdo lipídico foi analizado por cromatografia, sendo também obtidas as concentrações de proteína e colesterol destas frações de membrana. \201CDot blots\201D das frações foram positivos para marcadores universais de jangadas de lipídios (flotilina-1 e toxina B do cólera). Por imunofluorescência co-localizou-se marcação de transferrina e de anticorpos anti-flotilina no citóstoma. Assim, propomos que a endocitose de transferrina ocorre principalmente pelo citóstoma através de um domínio de membrana detergente-resistente. Epimastigotas foram também pré-tratadas para impedir especificamente endocitose mediada por clatrina e a endocitose por cavéolas, usando-se drogas que interferem com o citoesqueleto celular, seguindo-se incubação com transferrina. Dados de MET e citometria de fluxo mostraram que a endocitose de transferrina ocorreu normalmente nas amostras onde o brotamento de vesículas revestidas com clatrina foi impedido, não sendo porém observada nas amostras onde a endocitose por cavéolas foi inibida. Análise da curva de crescimento de parasitas tratados demonstrou uma relação positiva entre interferência nos domínios de membrana detergente-resistentes e sobrevivência das células. Este conjunto de dados permitiu elaborar um modelo dos mecanismos de endocitose em epimastigotas de T. cruzi.
Abstract: Endocytosis in eukaryotic cells is the in corporation process o f macromolecules, t hrough different pathways with different associated proteins, through vesicles budding at the plasma membrane and addressing of these vesicles to cytoplasmic endosomal compartments. Trypanosomatids are pathogenic flagellate protozoa of great medical and ve terinary importance that present different evolutive forms along their life cycle. These parasites are structurally organized inside a cage of subpelicular microtubules, what makes it difficult to form membrane invagination along most part of the cell body . However, this cage is missing at the flagellar pocket region, where the flagellum emerges from the cell. Epimastigote forms of Trypanosoma cruzi present besides the flagellar pocket a second membrane invagination, the cytostome/cytopharynx . This structur e is sustained by specialized microtubules that actively participate in the endocytic process. This thesis has investigated the endocytic pathways at the two competent sites for nutrient uptake (flagellar pocket and cytostome) of T. cruzi epimastigotes. Af ter parasites incubation at 28 o C with gold - conjugated albumin e , transferrin or LDL, followed by processing for transmission electron microscopy (TEM), it was possible to observe coated endocytic vesicles loaded with albumin, budding off from the flagellar pocket. Analysis of the proteic content of epimastigote forms detected the expression of clathrin, confirmed by flow cytometry and in silico analysis of the T. cruzi genomic database. Confocal microscopy allowed the visualization of the clathrin expression at the flagellar pocket. As transferrin was seen in uncoated vesicles located mainly in the cytostome, detergent - resistant membrane fractions were purified by cell fractioning and the lipidic contents was analyzed by chromatography, as well as the protein and cholesterol contents in the fractions. Dot blots of such membrane fractions were positive for lipid raft universal labels (flotillin - 1 and cholera B toxin). By immunofluorescence microscopy , transferrin and flotillin were co - localized at the cytostome . Thus we propose that endocytosis of transferrin occurs mainly through the cytostome via detergent - resistant membrane domains. Epimastigote forms were pre - treated to specifically hinder clathrin - mediated and caveolae - mediated endocytosis, by using drugs t hat impair these pathways and interfere with the cell cytoskeleton, followed by incubation with transferrin. Data from TEM and flow cytometry showed that the endocytosis of transferrin occurred normally in samples where budding of clathrin - coated vesicles was hindered, but it was not observed in samples where caveolae - mediated endocytosis was inhibited. Analysis of growth curves of treated parasites showed a relation between interference with detergent - resistant membrane domains and cell surviving. Our data allowed to elaborate a model depicting the endocytic mechanisms in Trypanosoma cruzi epimastigotes
DeCS: Trypanosoma cruzi
Endocitose
Transferrina
Lipídeos de Membrana
Issue Date: 2007
Citation: CORREA, J. R. Trypanosoma cruzi: Contribuição ao estudo da endocitose dependente e independente de clatrina em formas epimastigotas. 2007. 87f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, 2007.
Date of defense: 2007
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Teses de Doutorado

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