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Title: Estudo da modulação de proteínas de Trypanosoma cruzi em resposta ao estímulo de TGF-ßuma abordagem proteômica
Advisor: Lima, Leila de Mendonça
Waghabi, Mariana Caldas
Members of the board: Jorge, Tânia Cremonini de Araújo
Brandão, Adeílton Alves
Domont, Gilberto Barbosa
Levy, Claudia Masini d`Avila
Authors: Ferrão, Patrícia Mello
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: Estudos recentes mostraram que TGF-\03B2 esta envolvido na cardiopatia chagásica aguda e crônica. O aumento de seus níveis plasmáticos e a ativação da sua via de sinalização celular são aspectos peculiares da doença chagásica crônica. Além do seu relevante papel na patologia chagásica, também se observou que esta citocina está intimamente associada ao T. cruzi como um regulador de diferentes etapas de seus ciclo de vida. Trabalhos anteriores demostraram que T. cruzi é capaz de ativar TGT-\03B2 latente, utilizando-o na invação às células hospedeiras e que amastigotas de T. cruzi se ligam e internalizam TGF-\03B2 recombinante, estando este evento relacionado à capacidade de proliferação de amastigotas e sua diferenciação em tripomastigotas no final do ciclo intracelular. Este conjunto de informações nos levou ao questionamento de quais moléculas de T. cruzi poderiam estar envolvidas nos processos de proliferação e diferenciação celular frente ao estímulo por TGF-\03B2. Neste sentido, o presente projeto tem por principal objetivo a caracterização de moléculas responsivas ao estimulo de TGF-\03B2 através de uma abordagem fosfoproteômica. Para tal, extratos de proteínas totais de epimastigotas de T. cruzi (cepa Y), incubadas ou não com TGF-\03B2, foram preparados durante a fase exponencial de crescimento do parasito. Evidenciamos que a dose ótima de TGF-\03B2 para maior indução de fosforilação seria de 5 ng/ml. em seguida, o tempo ótimo de indução com TGF-\03B2 (1,5,15,30 e 60 minutos) foi testado e concluímos que as diferenças entre os padrões de fosforilação são muitos sutis em géis unidimensionais, nos fazendo optar pela análise exclusiava dos perfins em géis bidimensionais de 7 cm com faiza de PH 3-10 não-linear. A avaliação dos perfis bidimensionais demonstrou diferenças nos padrões de fosforilação entre os tempos estudados, nos levando a manter um estudo de cinética de tempo. As imagens dos géis foram analisadas e algumas das proteínas consideradas responsivas a TGF-\03B2 foram identificadas por espectrometria de massas. Observamos que as proteínas de choque térmico, tubulinas, desidrogenases, enolases, ciclofilina A, GrpE, cruzipaína, fator de elongamento 1-\03B1, fator de iniciação eucariótica 5a, entre outras, têm sua fosforilação e/ou expressão moduladas em resposta a TGF-\03B2. Buscamos correlacionar a função já descrita na literatura para cada proteína com seu possível papel na sinalização intracelular dsparada por TGF-\03B2, em concordância com o comportamento de fosforilação e/ou expressão apresentado em novas análises. Por último, foi avaliado se a adição de TGF-\03B2 a culturas de epimastigotas teria algum efeito sobre a proliferação dos parasitos. Verificamos que a adição de TGF-\03B2 promoveu um aumento de até 73% no crescimento dos parasitos nas primeiras 24 horas de estudo. O conjunto de dados obtidos contribui para a elucidação dos mecanismos moleculares relacionados à sinalização de TGF-\03B2, proporcionando uma fonte para detecção de novos alvos terapêuticos para a doença de Chagas
Abstract: Recent studies show that TGF - β is involved in the acute and chronic chagasic cardiopathy. High levels of TGF - β and the activation of its signaling pathway were shown to be peculiar aspects of patients with chron ic Chagas disease. Besides its relevant role in the pathology of Chagas dis ease, this cytokine was also observed to be intimately associated with Trypanosoma cruzi as a regulator of different stages of the parasite ́s life cycle. Previous works have show n that T. cruzi , using it in the process of h ost cell invasion. In addition, amastigote forms are able to bind and internalize recombinant TGF - β , and this event is related to their capacity to proliferate and differentiate int o trypomastigote forms at the end of the intracellular cycle. Taken togethe r, this set of information raises the question as molecules are involved in the processe of cellular proliferation and differentiation stimulated by TGF - β . Therefore, this work aims to characterize TGF responsive molecules through a pho sphoproteomic approach. For this purpose, total T. cruzi epimastigotes (Y strain), incubated or not with TGF were prepared from parasites in the exponential gro wth phase. We determined that 5 was the dose that induce d the highest number of phosphorylation events. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed only subtle differences using 1 -DE analysis, leadi ng us to evaluate these profiles DE gels (7cm pH 3 -10 non- linear). The profiles obtained showed differences in phosphorylation patterns duri ng the time - which led us to maintain a time - kinetics study. Gel images wer responsive proteins were identified by mass spectr ometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydr ogenases, enolases, cyclophilin A, GrpE, cruzipain, elongation factor - 1 α , eukaryotic initiation factor their phosphorylation and/or expression levels modu lated by TGF correlate the function already described in the lit erature for each protein with their possible role in intracellular signaling triggered by TGF - β , in agreement with thei phosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we assessed whether the addition of TGF - β to epimastigotes cultures would have some effect on parasite proliferation. We found that TGF - β addition led to an increase of up in parasite growth in the first 24 hours of culture . The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mec hanisms related to TGF , providing a source of new potential therapeutic t argets against in response to TGF - β is involved in the acute and chronic chagasic and the activation of its signaling pathway were shown to be peculiar aspects of patients with chron ic Chagas disease. Besides its ease, this cytokine was also observed to as a regulator of different stages of T. cruzi is able to activate ost cell invasion. In addition, amastigote , and this event is related to their capacity to proliferate and differentiate int o trypomastigote forms at the end of r, this set of information raises the question as molecules are involved in the processe of cellular proliferation and . Therefore, this work aims to characterize TGF - β sphoproteomic approach. For this purpose, total epimastigotes (Y strain), incubated or not with TGF - β , were prepared from parasites in the exponential gro wth phase. We determined that 5 d the highest number of phosphorylation events. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed ng us to evaluate these profiles linear). The profiles obtained - course under study, kinetics study. Gel images wer e analyzed and responsive proteins were identified by mass spectr ometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydr ogenases, enolases, cyclophilin , eukaryotic initiation factor -5a and others had their phosphorylation and/or expression levels modu lated by TGF - β . We tried to correlate the function already described in the lit erature for each protein with their , in agreement with thei r phosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we to epimastigotes cultures would have some addition led to an increase of up in parasite growth in the first 24 hours of culture . The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mec hanisms related to TGF - β , providing a source of new potential therapeutic t argets against Chagas disease
keywords: Fosfoproteoma
DeCS: Fator de Crescimento Transformador beta
Trypanosoma cruzi
Proteômica
Fosforilação
Issue Date: 2009
Citation: FERRÃO, P. M. Estudo da modulação de proteínas de Trypanosoma cruzi em resposta ao estímulo de TGF-ßuma abordagem proteômica. 2009. 108f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, 2009.
Date of defense: 11-06-2009
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Dissertações de Mestrado

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