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Title: Camundongos inoculados com DENV2 por via intracerebralhistopatologia, detecção viral e avaliação de proteção mediada por uma vacina de DNA
Advisor: Alves, Ada Maria de Barcelos
Members of the board: Pelagio, Marcelo
Bozza, Fernando
Lima, Flávia
Mota, Ester
Jacques, Cecília
Authors: Silva, Juliana Fernandes Amorim da
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: A dengue constitui um sério problema de saúde pública, principalmente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. Uma grande dificuldade para se estudar essa doença é a falta de um modelo animal que reproduza os efeitos da infecção observados em humanos. Apesar disso, um dos modelos mais utilizados para testes de vacinas contra a dengue se baseia na inoculação em camundongos por via intracerebral (i.c.) de vírus neuroadaptado. No entanto, poucos estudos avaliaram o efeito da infecção i.c. e/ou proteção gerada por protótipos vacinais em diferentes órgãos, tais como fígado, um dos órgãos comprometidos pela dengue em humanos. O nosso grupo construiu a vacina de DNA, pcTPANS1, que induziu altos níveis de sobrevivência em camundongos desafiados por via i.c. com vírus da dengue 2 (DENV2). Diante disso, o presente trabalho se propõe avaliar aspectos da patogênese no cérebro, cerebelo, fígado e pulmão, no modelo de camundongos BALB/c inoculados pela via i.c. com uma dose letal de DENV2, em diferentes dias após infecção (d.p.i.). Adicionalmente, tais análises foram estendidas para animais imunizados com a vacina pcTPANS1 e desafiados com DENV2. Detectamos alterações histopatológicas no cérebro/cerebelo (edema, hemorragia, gliose reacional, microglia hiperplásica e hipertrofiada e infiltrado mononuclear na pia-máter, no neurópilo e perivasculares), no fígado (edema, hemorragia, balonização hepatocitária, infiltrado mononuclear, hiperplasia e hipertrofia de células de Kupffer) e no pulmão (edema, hemorragia, infiltrados mononucleares peribronquiolares, aumento do número de macrófagos alveolares e espessamento de septo interalveolar) Alguns destes danos foram quantificados, utilizando uma escala subjetiva com atribuição de diferentes graus, revelando diferenças significativas. Os animais inoculados com DENV2 também apresentaram um aumento dos níveis séricos das enzimas hepáticas ALT e AST, principalmente de AST ao final da infecção, com diferenças significativas em relação aos controles. Por outro lado, em todos os tecidos dos camundongos vacinados com pcTPANS1 observamos uma melhora progressiva dos danos, quando comparados com os animais somente infectados. Também detectamos a presença do DENV2 no cérebro/cerebelo, no sangue e no pulmão dos animais em ensaios in vitro de infecção de células Vero e/ou por RT-PCR em tempo real. Nos animais somente infectados, observamos no cérebro/cerebelo altos títulos de partículas virais infecciosas e cópias de RNA viral. Já no soro, o maior percentual de animais com a presença de DENV2 foi entre o 90 e 110 d.p.i.. Por outro lado, não foi possível a detecção do vírus no fígado, e no pulmão a detecção foi muito baixa. Entretanto, verificamos a presença do antígeno NS3 de DENV2 não só no tecido nervoso, mas também no hepático, através de ensaios de imunohistoquímica. Em contrapartida, os animais vacinados com pcTPANS1 e desafiados com o vírus apresentaram uma redução drástica na viremia com DENV2. De um modo geral, os nossos estudos podem contribuir para uma melhor compreensão da patogênese da dengue, assim como servir de parâmetro para a avaliação da proteção induzida pela vacina pcTPANS1, bem como de outras vacinas
Abstract: The dengue is a serious public health problem, mainly in tropical and subtropical regions of the world. One of the great difficulty to study this disease is the lack of an animal model that mimics the infection effects observed in humans. Nevertheless, one of the most widely used model for vaccine tests against dengue is based on the inoculation of mice by the intracerebral route (i.c.) with neuroadapted virus. However, few studies have evaluated the effects of i.c. infection and/or protection generated by vaccine prototypes in different organs, such as the liver, one of the compromised organ in dengue in humans. Our group have constructed a DNA vaccine, pcTPANS1, which induced high survival rates in mice challenged by the i.c. inoculation with dengue virus 2 (DENV2). Therefore, the present work aim to evaluate aspects of the pathogenesis in the brain, cerebellum, liver and lung in the BALB/c mouse model intracerebrally inoculated with a lethal dose of DENV2, at different days post infection (d.p.i.). In addition, these analyzes were extended to pcTPANS1-immunized animals challenged with DENV2. We detect histopathological changes in the brain/cerebellum (hemorrhage, edema, reactive gliosis, hyperplasic and hypertrophied microglia and mononuclear infiltrate in the pia-mater, neuropile and perivascular), the liver (hemorrhage, edema, hepatocyte ballooning, mononuclear infiltrate, hyperplasia and hypertrophy of Kupffer cells) and the lung (hemorrhage, edema, peribronchial mononuclear infiltrates, increased number of alveolar macrophages and thickening of interalveolar septa). Some of these damages were quantified using a subjective scale with different degrees and revealing significant differences. Animals inoculated with DENV2 also showed increased serum levels of the liver enzymes AST and ALT, mainly AST on the end of infection, with significant differences compared to controls. On the other hand, in all the tissues of pcTPANS1-vaccinated mice, we observed a progressive improvement of damages when compared with only infected animals. We also detected the presence of DENV2 in the brain/cerebellum, blood and lung of animals by in vitro assays of infected Vero cells and/or by real time RT-PCR. In only infected animals, we observed high titers of infectious viral particles and viral RNA copies in brain/cerebellum. In serum, the highest percentage of animals with infeccious DENV2 particles was found between 90 and 110 d.p.i.. However, it was not possible to detect the virus in the liver, and the detection in lung was very low. Despite of this, we verified the presence of DENV2 antigen, NS3, not only in nervous tissue but also in liver, by immunohistochemistry assays. In contrast, pcTPANS1-vaccinated animals challenged with the virus showed a drastic reduction of viremia with DENV2. In general, our studies may contribute to a better understanding of dengue pathogenesis, and also serve as a parameter for evaluation of the vaccine-induced protection with pcTPANS1, as well as with other vaccines.
DeCS: Muridae
Patologia
Vírus da Dengue
Vacinas de DNA
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Issue Date: 2015
Citation: SILVA, J. F. A. da. Camundongos inoculados com DENV2 por via intracerebralhistopatologia, detecção viral e avaliação de proteção mediada por uma vacina de DNA. 2015. 163f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2015
Date of defense: 2015-10-29
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Dissertações de Mestrado

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