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Title: Análise de diferentes cepas de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis quanto a infectividade/virulência e perfil de citocinas e quimiocinas produzidas por macrófagos murinos infectados
Advisor: Mendonça, Sérgio Coutinho Furtado de
Members of the board: Alves, Carlos Roberto
Silva, Adriano Gomes
Amaral, Veronica Figueiredo do
Souza, Celeste da Silva Freitas de
Cândido, Jussara Lagrota
Authors: Machado, Michelle Menezes
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por diversas espécies de protozoários do gênero Leishmania, clinicamente classificadas como leishmaniose tegumentar e leishmaniose visceral. As leishmanioses representam um grave problema de saúde pública no Brasil, onde já foram registradas em todos os estados. Considerando que os mecanismos pelos quais as diferentes espécies de Leishmania causam diferentes patologias ainda são amplamente desconhecidos, pretendeu-se caracterizar diferenças no perfil de citocinas e quimiocinas produzido por macrófagos murinos infectados com L. (Leishmania) amazonensis e L. (Viannia) braziliensis, espécies causadoras de leishmaniose tegumentar americana no Brasil e investigar uma possível relação entre os resultados deste trabalho e as características imunopatológicas das infecções com as espécies em estudo. Macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c foram infectados com diferentes cepas de L. (L.) amazonensis e de L. (V.) braziliensis. A carga parasitária e a taxa de infecção de macrófagos foram determinadas através de microscopia ótica. As cepas de L. (L.) amazonensis apresentaram uma maior variabilidade intraespecífica do que as de L. (V.) braziliensis, porém sem diferença estatisticamente significante A produção de NO foi avaliada por meio da reação de Griess. Todas as cepas de L. (L.) amazonensis induziram a produção de NO, enquanto que apenas na infecção por uma cepa de L. (V.) braziliensis observaram-se níveis detectáveis de NO. Entretanto, esta aparente diferença também não foi estatisticamente significante. A produção de ureia foi determinada através da ocorrência da reação de hidrólise de L-arginina pela enzima arginase. Observou-se que a produção de ureia nas culturas infectadas por L. (V.) braziliensis foi mais heterogênea do que nas infectadas por L. (L.) amazonensis. Observou-se também uma correlação inversa forte e significativa (Spearman r = -0,8051; p = 0,0218) entre os níveis de nitrito e de uréia caracterizando as duas vias de ativação macrofágica: clássica e alternativa, respectivamente. Citocinas e quimiocinas foram dosados nos sobrenadantes dos macrófagos infectados através da técnica de Luminex e a avaliação da expressão gênica destas citocinas e quimiocinas foi realizada por meio do PCR Multiplex em tempo real. Observaram-se importantes diferenças entre o perfil de citocinas e quimiocinas caracterizados através de Luminex e de PCR Multiplex em tempo real Apesar disso, ambos os métodos mostraram níveis mais altos de citocinas e quimiocinas nas culturas infectadas com L. (V.) braziliensis em comparação às infectadas com L. (L.) amazonensis. Os resultados do Multiplex mostraram ausência de diferença estatística entre os macrófagos infectados por L. (L.) amazonensis e o controle de macrófagos não infectados. Por outro lado, nas culturas infectadas por L. (V.) braziliensis houve um aumento significativo (p < 0,05) da expressão gênica das citocinas IL-1\03B1, IL-6, G-CSF e da enzima NOS, além do aumento sugestivo (p<0,1) da expressão da citocina IL-10, da quimiocina CCL3 e dos receptores de quimiocinas CCR2 e CCR5. Concluiu-se, portanto, que a infecção por L. (V.) braziliensis modulou uma resposta predominantemente pró-inflamatória nos macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, enquanto que não foi observada alteração na expressão de qualquer dos genes alvos do estudo na infecção com a espécie L. (L.) amazonensis em relação às culturas controle não infectadas
Abstract: Leishmaniasis is a group of diseases caused by vari ous species of protozoa of the genus Leishmania , clinically classified as cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis. Leishmaniasis represents a serious p ublic health problem in Brazil, where the desease has been registered in all states . Whereas the mechanisms by which the different species of Leishmania cause different diseases are still largely unknown, we sought to characterize differences in t he profile of cytokines and chemokines produced by murine macrophages infected with L. (Leishmania) amazonensis and L. (Viannia) braziliensis species, both of them causing American cutaneous leishmaniasis in Brazil, and to investiga te a possible relationship between the results of this work and the immunopathological characteristics of the infections with these species. Peritoneal macrophages from BAL B/c mice were infected with different L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis strains. The parasite load and the infection rate of macrophages were determined b y optical microscopy. The L. (L.) amazonensis strains apparently showed greater intraspecific va riability than those of L. (V.) braziliensis , although no statistically significant difference was found. NO production was assessed by the Griess reaction. All strains of L. (L.) amazonensis induced NO production while detectable NO levels we re observed only in the infection by one strain of L. (V.) braziliensis . However, this apparent difference was not statistically significant. The urea production was determined by the occurrence of the hydrolysis reaction of L-arginine by the enzyme arginase. It was observed that urea production in cultures infected by L. (V.) braziliensis was more heterogeneous than in those infected by L. (L.) amazonensis . We also observed a strong and significant inverse correlation (Spearman r = -0.80 51, p = 0.0218) between the levels of nitrite and urea featuring the two routes of mac rophage activation: classical and alternative, respectively. Cytokines and chemokines were measured in the supernatants of infected macrophages through the Lu minex technique and the assessment of gene expression of these cytokines an d chemokines was performed using real-time PCR Multiplex. Important difference s were observed between the profile of cytokines and chemokines revealed by Lum inex and real-time PCR Multiplex. Nevertheless, both methods showed higher levels of cytokines and chemokines in cultures infected with L. (V.) braziliensis as compared to those infected with L. (L.) amazonensis . The Multiplex results showed no statistical difference between macrophages infected with L. (L.) amazonensis and uninfected macrophages control. On the other hand, in cultures infected with L. (V.) braziliensis xii there was a significant increase (p<0.05) of gene e xpression of IL-1 α , IL-6, G-CSF cytokines and NOS enzyme, and also a suggestive inc rease (p < 0.1) of the expression of the cytokine IL-10, the chemokine CCL 3 and CCR2 and the chemokine receptors CCR5. Therefore, it was concluded that in fection with L. (V.) braziliensis modulated a response predominantly proinflammatory in peritoneal macrophages from BALB/c mice, whereas no change was observed in the expression of any target gene in infections with L. (L.) amazonensis when compared to uninfected control cultures
DeCS: Citocinas
Quimiocinas
Leishmania braziliensis
Reação em Cadeia da Polimerase Multiplex
Macrófagos Peritoneais
Issue Date: 2014
Citation: MACHADO, M. M. 2014. 114f. Análise de diferentes cepas de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis quanto a infectividade/virulência e perfil de citocinas e quimiocinas produzidas por macrófagos murinos infectados Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2014
Date of defense: 2014-05-07
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação Biologia Parasitária
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBP - Dissertações de Mestrado

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