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Title: Otimização de protocolos de testes moleculares para detecção e quantificação do vírus da Hepatite C em sangue coletado em papel de filtro
Advisor: Villar, Lívia Melo
Members of the board: Filippis, Ana Maria Bispo de
Favacho, Alexsandra Rodrigues de Mendonça
Ferreira, Davis
Santos, Flavia Barreto dos
Almeida, Adilson José de
Authors: Marques, Brunna Lemos Crespo
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: O diagnóstico da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) é feito pela detecção de marcadores sorológicos e moleculares, porém o custo destas metodologias é bastante elevado e a coleta de sangue para a realização destes ensaios além de requerer pessoal treinado, é difícil em áreas remotas ou com poucos recursos. O objetivo deste estudo foi otimizar protocolos e padronizar métodos de diagnóstico molecular para infecção pelo HCV em amostras de sangue coletado em papel de filtro (SPF) para facilitar o acesso ao diagnóstico em áreas remotas ou com recursos limitados. Para isto, 99 indivíduos forneceram amostras pareadas de soro e SPF, dentre os quais 59 eram anti-HCV reagente e 40 eram não reagentes em suas amostras de soro. As amostras anti-HCV reagentes foram submetidas à técnica de quantificação comercial. Para o desenvolvimento da RT-PCR quantitativa (RT-qPCR) in house, uma curva padrão interna foi construída utilizando um plasmídeo contendo o inserto do HCV e iniciadores e sonda foram desenhados para a região 5´NC do HCV. Para otimização da técnica, a concentração de cDNA, transcriptase reversa e números de ciclos de reação foram avaliados. Para a extração de RNA de HCV em amostras de SPF, sete métodos foram avaliados. A sensibilidade, especificidade, correlação, reprodutibilidade e presença de inibidores da RT-PCR quantitativa também foram determinados. O conjunto de QIAamp DNA Mini Kit foi o método mais eficiente para extração do RNA do HCV em SPF. A RT-qPCR in house desenvolvida foi capaz de quantificar o HCV no soro de 44 amostras onde a mediana de carga viral foi inferior aquela observada na técnica comercial (log10 4,94 e log10 6 cópias de HCV/mL, respectivamente). A faixa de detecção do método in house foi de 10 a 109 cópias de HCV por reação Para a detecção de HCV em SPF foi necessário o aumento da transcriptase reversa e de cDNA, permitindo que 35 amostras fossem detectadas com um limite mínimo de detecção igual a 58,5 cópias/mL e a mediana de carga viral foi semelhante à observada nas respectivas amostras de soro avaliadas pela técnica comercial (log10 5,38 e log10 5,89 cópias de HCV/mL, respectivamente). Obteve-se boa reprodutibilidade da RT-qPCR in house através da análise da curva padrão e de amostras de soro e SPF. Não foi observada a presença de inibidores de reação utilizando o GAPDH como controle interno. Quando comparado com a metodologia comercial, a RT-qPCR apresentou sensibilidade de 74,58% (IC95% 61,5-85,0) em soro e 59,3% (IC95% 45,7-71,9) em SPF, e a especificidade foi igual a 100% para ambos espécimes. Quando a RT-qPCR foi avaliada entre os dois espécimes clínicos, a sensibilidade da técnica em SPF foi igual a 65,9% (IC95% 50,0-79,5) e a especificidade foi igual a 100%. Quarenta e cinco amostras de soro e quinze amostras de SPF foram amplificadas na RT-PCR qualitativa, onde 43 amostras de soro e 11 amostras de SPF foram sequenciadas. Entre as amostras de soro, 29 foram classificadas como subgenótipo 1b, 13 como subgenótipo 1a, 1 como genótipo 3. Entre as amostras de SPF, 9 foram classificadas como subgenótipo 1b e 2 como subgenótipo 1a. Foi observada alta homologia nucleotídica entre as sequencias de HCV das amostras pareadas de soro e SPF onde todas foram classificadas como genótipo 1. Conclui-se que o sangue em papel de filtro pode ser utilizado para detecção, quantificação e análise filogenética do HCV, sendo uma ferramenta promissora para estudos de epidemiologia da hepatite C
Abstract: The d iagnosis of hepatitis C virus (HCV) infection is made by detection of molecular and serologic al markers, but the cost of these methodologies is quite high and blood sample collection requires trained personnel what it is difficult in remote areas or prese nting few resources. The aim of this study was to optimize protocols and standardize molecular diagnostic methods for HCV infection in dried blood samples (DBS) to facilitate access to diagnosis in remote areas or with limited resources. For this, 99 indiv iduals provided paired serum and DBS samples , where 59 of them were anti - HCV rea ctive and 40 were non - reactive in their serum samples. A nti - HCV positive samples were subjected to commercial quantification technique. For the development of quantitative RT - P CR (RT - qPCR) in house, an internal standard curve was constructed using a plasmid containing the insert and HCV primers and probe designed for the 5' non coding ( NC ) region of HCV. For optimization of these technique s , the concentration of cDNA, reverse tr anscriptase and numbers of cycles of reaction were evaluated. For the extraction of HCV RNA in DBS samples, seven methods were evaluated. The sensitivity, specificity, correlation, reproducibility and presence of inhibitors in quantitative RT - PCR were also determined. Q IAamp DNA Mini Kit was the most efficient method for HCV RNA extraction among DBS samples . The in house RT - qPCR was able to quantify HCV among 44 serum samples where the median viral load was lower than that observed in commercial technique ( 4.94 log 10 and 6 log 10 copies of HCV / mL, respectively). The range of HCV detection using in house RT - qPCR was 10 - 10 9 copies of HCV per reaction. For HCV detection in DBS , it was necessary to increase reverse transcriptase and cDNA concentration giving 35 HCV RNA reactive samples with a limit of detection equal to 58.5 copies of HCV / m L and the median viral load was similar to that observed in their sera evaluated by commercial technique (5.38 log 10 and 5.89 log 10 copies of HCV / mL, respectively). In hous e RT - qPCR presented good reproducibility using standard curve and paired DBS and sera samples . It was not observed the presence of inhibitors of the reaction using GAPDH as internal control. In house RT - qPCR showed a sensitivity of 74.58% (95% CI 61.5 to 8 5.0) in serum and 59.3% (95% CI 45.7 to 71.9) in DBS, and the specificity was 100% for both specimens compared to the commercial methodology . When the RT - qPCR was evaluated in two clinical specimens, the sensitivity of the technique in DBS was equal to 65. 9% (95% CI 50.0 to 79.5) and specificity was 100%. Forty - five serum samples and 15 DBS samples were amplified in qualitative RT - PCR, where 43 serum samples and 11 DBS samples were sequenced. Among the serum samples, 29 were classified as HCV subgenotype 1b , 1 3 as subgenotype 1a, genotype 1 and 3. Among DBS samples, 9 were 9 classified as HCV subgenotype 1b and 2 as HCV subgenotype 1a. HCV nucleotide sequences presented high homology between paired DBS and sera samples and all of them were classified as geno type 1. It is conclude that dried blood spot may be used for detection, quantification and phylogenetic analysis of HCV and it is a promising tool for studying the epidemiology of hepatitis C
DeCS: Hepatite C
Hepacivirus
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Coleta de Amostras Sanguíneas
Técnicas de Genotipagem
Issue Date: 2013
Citation: MARQUES, B. L. C. Otimização de protocolos de testes moleculares para detecção e quantificação do vírus da Hepatite C em sangue coletado em papel de filtro. 2013. 100f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2013
Date of defense: 2016-01-13
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBP - Dissertações de Mestrado

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