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Title: Sinalização de morte celular via NA+, K+-ATPase como alvo de drogas anticâncer: estudos com o álcool perílico
Advisor: Faria Neto, Hugo Caire de Castro
Members of the board: Almeida, Cecília Jacques Gonçalves de
Fernandes, Janaina
Ferreira, Luiz Roberto Leão
Silva, Adriana Ribeiro
Gallo, Cláudia Vitória de Moura
Authors: Garcia, Diogo Gomes
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: A Na+, K+ ATPase (NKA) atua na manutenção do potencial de membrana das células e em mecanismos de transdução de sinal. Alterações na atividade da NKA são importantes em muitos processos biológicos e patológicos. A NKA pode ser inibida pelo álcool perílico (POH), um monoterpeno utilizado no tratamento de tumores, incluindo cerebrais. Neste trabalho, determinamos que o POH também atua sobre cascatas de sinalização, moduladas via NKA, que controlam a proliferação e/ou morte celular. Foi avaliado o efeito do POH e do PA seu principal metabólito, sobre a atividade da NKA em duas linhagens de células de glioblastoma (GBM) humano (U87 e U251), células não tumorais de astrócitos de camundongo e da linhagem (VERO). Nossos resultados, baseados na avaliação da atividade da NKA por incorporação do Rb+, o qual mimetiza o K+, mostraram uma sensibilidade à inibição pelo POH semelhante entre os quatro tipos de células (IC50 U87 2 mM; U251 1,8 mM; VERO 2,4 mM e astrócitos de camundongo 1,4 mM), enquanto o PA não apresentou efeito. Sabe-se que nos GBMs existe uma superexpressão da subunidade \03B11 da NKA, situada na estrutura das cavéolas que é provavelmente responsável pelo papel sinalizador atribuído a essa enzima, especialmente em relação aos mecanismos apoptóticos. Comparamos a viabilidade celular, determinando a atividade da enzima lactato desidrogenase presente no sobrenadante das células tratadas por 24 h com POH e PA O PA não alcançou efeito citotóxico igual ou superior a 30% nas células mesmo na concentração elevada de 4 mM. Já o POH reduziu, de maneira dependente da concentração, a viabilidade das células (IC50 U87 1,1 mM; U251 1,4 mM; VERO 0,9 mM e astrócitos de camundongo 1,4 mM). Na análise por western blot, 1,5 mM de POH ativou a proteína c-Jun N-terminal quinase (JNK), nas células U87, U251 e nos astrócitos de camundongo (incubação de 30 min). O uso do inibidor Src quinase (dasatinibe) e a depleção colesterol da membrana celular com metil \03B2-ciclodextrina reduziram a ativação da JNK1/2 induzida pelo POH nas células U87, indicando a possível participação do complexo NKA-Src (presente nas cavéolas), nesta via de sinalização. POH (1,5 mM) aumentou a liberação da interleucina IL-8, detectada por ELISA, no sobrenadante das células U251 (24 h incubação), indicando possível estratégia destas células para evitar o efeito citotóxico do POH. Resultados obtidos com citometria de fluxo mostram que a inibição da JNK1/2 (pelo inibidor JNK V) reduz a apoptose ocasionada pelo POH nas células de GBM, indicando o envolvimento desta proteína na morte celular programada. Os resultados obtidos mostram que o mecanismo de sinalização celular mediado pela NKA pode ter um importante papel no mecanismo de ação antitumoral do POH em células de GBM
Abstract: The Na + , K + ATPase (NKA) acts in keeping the cell membrane potential and in signal transduction mechanisms . Modifications in the activity of this enzyme are important in physiological and patholog ical processes. The NKA is inhibited by perillyl a lco h ol (POH), a monotherpene used in the treatment of tumors, including brain tumors. In this work , we also show that POH act s in signal ing cascades associated to NKA, controlling cell proliferation and/or cellular death. We evaluated the effect of POH and o f its main metabolite (peri l lic acid - PA) on the NKA a ctivity in cultured glioblastoma cells ( GBM) U87 and U251 and on non - tumor cells (mouse astrocytes and VERO cells) . N AK activity was measured by non - radioactive Rb + incorporation by cells (Rb + is a K + substitute). Our results showed a similar sensitivity for the four cells types tested (IC 50 U87 – 2 mM; U251 - 1,8 mM; VERO - 2,4 mM and mouse astrocy tes - 1,4 mM). Peri l lic acid did no t show any effect i n any cell type. In GBMs , it is known that NKA α 1 subunit is super expressed. Thi s isoform is embedded in caveolar structures and is probably responsible by the signaling properties of this enzyme in apoptosis mechanisms. Cell viability was measured by lactate dehydr o genase in cell supernatants of POH treated cells. The maximum PA cy totoxic effect obtained was 30% even at 4 mm. However, POH reduced dose dependently cell viability , (IC 50 U87 - 1,1 mM; U251 - 1,4 mM ; VERO - 0,9 mM and mouse astrocyte - 1,4 mM). Considering the western blot analysis, 1,5 m M POH activated the c - Jun N - terminal K inase (JNK), on U87, U251 and in mouse astrocy tes after 30min incubation . D a satinib (an inhibitor of Src K inase) and methyl β - ci clodextrin (which promotes cholesterol depletion in cell membrane s ) reduced JNK 1/2 activation induced by POH in U87 cells, indicating the participation of NKA - Src comp lex seen in caveolar structure in this mechan ism. 1,5mM POH a fter 24h incubation incr ease interleuk in IL - 8 in U251 cell supernatant, and this may indicate a possible strategy to avoid the cy totoxic effect of POH. Results obtained by flux cy tometry showed that the inhibition of JNK1/2 (by the inhibitor JNK V) reduced apoptosis consequent to POH administration in GBM cells, indicating the involv e ment of this protein in programmed cellular death. Our results seem to indicate that a signaling mechanism mediate d by NKA may have an important role in ant i - tumor al action of POH in GBM cells.
GARCIA, D. G. Sinalização de morte celular via NA+, K+-ATPase como alvo de drogas anticâncer: estudos com o álcool perílico. 2013. 86f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2013
DeCS: Adenosina Trifosfatase
Proteínas Proto-Oncogênicas c-jun
Monoterpenos
Glioblastoma
Issue Date: 2013
Citation: GARCIA, D. G. Sinalização de morte celular via NA+, K+-ATPase como alvo de drogas anticâncer: estudos com o álcool perílico. 2013. 86f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2013
Date of defense: 2013-11-21
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Teses de Doutorado

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