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Title: Envolvimento do receptor TLR-9 na resposta imune do hospedeiro durante o curso da infecção pelo Mycobacterium leprae
Advisor: Pessolani, Maria Cristina Vidal
Members of the board: Pinheiro, Roberta Olmo
Bozza, Fernando Augusto
Bellio, Maria
Moraes, Milton Ozório
Pereira, Verônica Schmitz
Authors: Dias, André Alves
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: Mycobacterium leprae, agente etiológico da hanseníase, expressa em abundância uma proteína catiônica semelhante às histonas, denominada Hlp, presente tanto no envelope como no nucleóide bacteriano. O reconhecimento do DNA bacteriano, rico em motivos CpG não metilados, pelo receptor TLR-9 representa uma importante via para a ativação da resposta imune inata, a qual pode levar à eliminação do agente infeccioso ou mediar manifestações patológicas. Foi mostrado ainda que complexos DNA-histona são mais potentes agonistas de TLR-9 que DNA sozinho. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar o envolvimento do receptor TLR-9 na ativação da resposta imune do hospedeiro durante o curso da infecção pelo M. leprae. Inicialmente foi analisada a participação do TLR-9 na ativação da resposta imune inata em células epiteliais alveolares da linhagem A549 após estímulo com M. leprae. M. leprae foi capaz de induzir aumento das quimiocinas IL-8 e MCP-1 e a transcrição gênica do peptídeo antimicrobiano H\F062D-2 nas células epiteliais. O aumento da expressão de CD80 na superfície celular também foi observada após estímulo com o bacilo. O complexo CpG-Hlp micobacteriano solúvel também induziu aumento na produção de IL-8 nas células A549. Foi observado que o aumento de IL-8 induzido pelo M. leprae ocorre de forma dependente da translocação nuclear do NF-\F06BB e que o antagonista sintético de TLR-9 afetou a secreção de IL-8 induzida pelo M. leprae. A adição de CpG ao M. smegmatis selvagem, mas não mutante para o gene hlp, aumentou a produção de IL-8 pelas células epiteliais Em conjunto, esses dados sugerem que as células epiteliais respiratórias podem reconhecer M. leprae via TLR-9 e, assim, participar da resposta imune inata no sítio inicial da infecção. Uma vez que o aparecimento do eritema nodoso hansênico (ENH) está associado a liberação massiva de antígenos micobacterianos, foi investigado o envolvimento do TLR-9 na patogênese do ENH. Neste sentido, foi verificado o aumento da expressão de TLR-9, tanto em lesões de pele como em células mononucleares periféricas de pacientes reacionais, quando comparados com pacientes não reacionais. Posteriormente foram quantificados os níveis de ligantes de TLR-9 na circulação dos pacientes. Além de DNA de M. leprae, altos níveis de Hlp foram detectados no soro de pacientes reacionais. Como o TLR-9 também reconhece DNA endógeno, os níveis circulantes do complexo DNA-histona humano foram quantificados e observou-se um aumento destes complexos no soro de pacientes reacionais. Demonstramos que PBMCs de pacientes reacionais secretam níveis aumentados das citocinas TNF-\F061, IL-6 e IL-1\F062 em resposta ao complexo CpG-Hlp em comparação a pacientes não reacionais e indivíduos sadios. Finalmente, o antagonista sintético de TLR-9 inibiu a secreção das citocinas pelas PBMCs em resposta ao lisado de M. leprae. Em conjunto, esses resultados sugerem um importante envolvimento do receptor TLR-9 no processo inflamatório desencadeado no ENH abrindo perspectivas para novas abordagens imunoprofiláticas e terapêuticas
Abstract: Mycobacterium leprae , etiological agent of leprosy, expresses in abundance a cationic protein similar to histones, called histone - like protein ( Hlp ) , present in the envelope as well as in bacterial nucleoid. The r ecognitio n of bacterial DNA rich in unmethylated CpG motifs by TLR - 9 is an important pathway for activation of the innate immune response, which can lead to the elimination of the infectious agent or mediate pathological manifestations. Moreover, studies showed tha t DNA - histone complexes are mor e potent agonists of TLR - 9 than DNA alone . This study aimed to investigate th e involvement of TLR - 9 in the activation of the host immune response d urin g the course of M. leprae infection. Initially, we analyzed the participat ion of TLR - 9 activation on the innate immune response in A549 alveolar epithelial cells after stimulation with M. leprae . It was shown that M. leprae was able to induce the chemokines I L - 8 and MCP - 1 , and gene transcription of antimicrobial peptide H  D - 2 in epithelial cells. T he increase of CD80 expression on the cell surface was also observed after stimulation with bacillus. Soluble mycobacterial CpG - Hlp complex also induced an increase in IL - 8 in A549 cells. It was observed that the increase of IL - 8 , induc ed by M. leprae , occurs dependently nuclear translocation of NF -  B and synthetic TLR - 9 antagonist affected IL - 8 secretion induced by M. leprae . T he addition of CpG to wild type M. smegmatis , but not to the mutant gene hlp , increased IL - 8 production by epit helial cells. A s a whole , t he se results suggest that respiratory epithelial cells can recognize M. leprae via TLR - 9 and thus participate in the innate immune response in the initial infection site. Since the appearance of erythema nodosum leprosum (ENL) is associated with the massive release of mycobacterial antigens , it was investigated the involvement of TLR - 9 in the pathogenesis of ENL. In this sense, we observed an increase in expression of TLR - 9, both in skin lesions and peripher al mononuclear cells of ENL patients, when compa red with non reactional patients. Subsequently, we measured the levels of TLR - 9 ligands in the circulation of patients. In addition to M. leprae DNA , high levels of Hlp were detected i n the seru m of ENL patients . As TLR - 9 also recog nize s endogenous DNA, circulating levels of the human DNA - histone complex were quantified , and we also observed an increase of these complexes in the serum of ENL patients. Furthermor e, PBMCs from ENL pa tients secreted elevated levels of TNF -  , IL - 6 and IL - 1  cytokines in response to CpG - Hlp complex , when compared to nonreactional patients and healthy individuals. F inally, synthetic antagonist of TLR - 9 inhibited the secretion of cytokines by P BMCs in respo nse to M. leprae lysates . The results described in t he second part of the study suggest a major involvement of TLR - 9 receptor in the inflammatory process triggered in ENL , opening up prospects for new immunoprophylactic and therapeutic approaches.
DeCS: Receptores Toll-Like
Mycobacterium leprae
Histonas
DNA
Imunidade nas Mucosas
Células Epiteliais
Eritema Nodoso
Hanseníase Virchowiana
Issue Date: 2015
Citation: DIAS, A. A. Envolvimento do receptor TLR-9 na resposta imune do hospedeiro durante o curso da infecção pelo Mycobacterium leprae. 2015. 152f. Tese (Doutorado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2015
Date of defense: 2015-09-10
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBP - Teses de Doutorado

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