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Title: Expressão gênica e localização celular de calpaínas em Trypanosoma cruzi
Advisor: Levy, Claudia Mansini d’Avila
Menna-Barreto, Rubem Figueiredo Sadok
Members of the board: Pons, Andrea Henriques
Silva, Narcísa Leal da Cunha e
Silveira, José Franco da
Santos, Eduardo Caio Torres dos
Silva, Silvia Amaral Gonçalves da
Authors: Vidal, Vítor Ennes
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: As calpaínas são cisteíno-peptidases intracelulares dependentes de cálcio classicamente citosólicas envolvidas em diversas funções moduladores da célula, como transdução de sinais, divisão celular, apoptose e diferenciação. Embora melhor caracterizadas em mamíferos, as calpaínas já foram descritas em insetos, nematódeos, plantas, fungos, protozoários e bactérias. No Trypanosoma cruzi, como nos demais tripanossomatídeos, já foi descrita a presença de uma ampla e diversa família de calpaínas em seu genoma, mas pouco se sabe a respeito das suas funções específicas. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo buscar as sequências de calpaínas do T. cruzi em seu genoma no intuito de classificá-las, assim como avaliar a expressão gênica das sequências de maior similaridade com as calpaínas de mamíferos. Além disso, um anticorpo gerado contra uma sequência peptídica conservada entre as calpaínas selecionadas foi utilizado em ensaios de identificação, expressão e localização celular. Nesse contexto, as análises in silico identificaram ao todo 55 sequências relacionadas às calpaínas no genoma do T. cruzi. Em seguida, através de alinhamentos múltiplos e análise de domínios conservados, foi possível classificar as calpaínas em quatro grupos distintos de acordo com a presença de domínios conservados característicos desta família multigênica. Dos quatro grupos identificados, foi selecionado para aprofundamento do estudo aquele que possuía o maior número de domínios conservados e continha o domínio que alberga o sítio catalítico das calpaínas (conservado ou não) A análise de expressão gênica de um total de dezesseis genes selecionados por qPCR revelou a presença de seis genes com expressão aumentada nas formas clinicamente relevantes (amastigotas e tripomastigotas) em relação as formas epimastigotas, e cinco genes nesta última forma. Em paralelo, o anticorpo anti-calpaínas se mostrou reativo em ensaios de Western Blotting, citometria de fluxo e microscopia de eletrônica de transmissão. Os ensaios de Western Blotting revelaram uma calpaína específica em amastigotas e outra em tripomastigotas, além de outras sete de massas moleculares variadas presentes nas três formas do parasito. Os resultados de citometria de fluxo indicam maior marcação intracelular do anticorpo nas formas amastigotas e tripomastigotas em relação aos epimastigotas. Por fim, as análises ultraestruturais revelaram a presença das calpaínas em todo citoplasma, nas membranas de vesículas, na membrana plasmática, e no flagelo das diferentes formas do parasito. O estudo comparativo da expressão das calpaínas nas formas evolutivas do T. cruzi, assim como a determinação de sua localização celular, podem ajudar a determinar as funções gerais desta família multigênica no parasito
Abstract: Calpains comprise a family of calcium dependent cy steine peptidases commonly present in cytoplasm implicated in a broad range of cellular modular functions such as signal transduction, cellular division, apoptosis and differentiation processes. Although well - characterized in mammals, these peptidases have also been described in insects, nematodes, plants, fungi, protozoa and bacteria . In Trypanosoma cruzi , as in other trypanosomatids, the presence of an extensive and diverse family of calpain s had already been described in its genome . However, the specific functions of these molecules are still unclear. In this context, the present study aimed to search calpain sequences in T. cruzi genome to classify the genes and to evaluate mRNA expression levels of the most conserved calpain sequences . In addition, an a ntibody against T. cruzi calpain was produced from a conserved sequence of trypanosomatid calpains to evaluate these proteases levels, also determining their ultrastructural localization. At first, in silico analysis revealed a total of 55 calpain sequence s in T. cruzi genome . Through multiple alignments and phylogenetic analysis of conserved domains in the se sequences, the calpains were sorted into four distinct groups characterized by the presence of classical domains of this multigenic family. After this in silico analysis, we decided to scrutiny the group that has the highest number of conserved domains and presents domain II, which contains the catalytic active site (either altered or conserved), in order to analyze mRNA and protein e xpression patterns in the different T. cruzi forms. The comparison of calpain mRNA abundance of sixteen genes by qPCR in the three distinct parasite forms revealed six genes with increased expression in the clinical relevant forms (amastigotes and trypomas tigotes) and five in the invertebrate form. S imultaneously , the anti - tritryp - calpain antibody was capable of recognizing reactive molecules in Western Blotting, flow citometry and transmission electron microscopy analysis. Altogether, Western Blotting anal ysis revealed seven calpains with different molecular masses present in the three forms of the parasite, while one specific calpain was detected either in amastigotes or tripomastigotes. Also, flow citometry results showed a higher intracellular expression in amastigotes and trypomastigotes in comparison with epimastigotes. Finally, ultrastructural analysis revealed the presence of theses proteases in the cytoplasm, vesicular membranes, plasma membranes and flagellum of the three life cycle forms. The compa rative study of calpain gene expression in the distinct T. cruzi forms, as well as the cellular localization of these molecules could be useful approaches to find out the calpain main functions in this parasite.
DeCS: Trypanosoma cruzi
Calpaína
Expressão Gênica
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Issue Date: 2015
Citation: VIDAL, V. E. Expressão gênica e localização celular de calpaínas em Trypanosoma cruzi. 2015. 119f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2015.
Date of defense: 2015-Dez-16
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Teses de Doutorado

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