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Title: Caracterização de serina peptidases e identificação do perfil proteico em intestino de Culex quinquefasciatus, Anopheles albitarsis s.s e Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)
Advisor: Jesus, José Batista de
Members of the board: Brazil, Reginaldo
Padrón, Gabriel
Brandão, Adeilton
Castro, Daniele Pereira de
Santos, André Luís Souza dos
Authors: Veloso, André Borges
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Os dípteros Aedes aegypti, Anopheles albitarsis e Culex quinquefasciatus pertencem à família Culicidae e são considerados um problema de saúde pública quando atuam como vetores de parasitos e/ou arboviroses. O regime de alimentação de fêmeas dos mosquitos anautógenos influencia os processos que ocorrem no intestino e regula os genes envolvidos na reprodução. Além disso, apesar dos ciclos de vida dos parasitos veiculados por essas espécies de vetores serem distintos, todos eles são ingeridos durante a hematofagia e expostos ao ambiente do intestino médio (estômago) para em seguida atravessar o epitélio intestinal e chegarem ao tecido apropriado para seu desenvolvimento e/ou transmissão para um novo hospedeiro vertebrado. Neste trabalho, utilizamos uma abordagem proteômica para a identificação de proteínas totais, bem como ensaios em solução e enzimografia em gel copolimerizado com substrato para identificação de peptidases ativas presentes no intestino de fêmeas de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis s.s sob regime de alimentação com açúcar. As técnicas de enzimografia também foram utilizadas aqui para a caracterização de peptidases ativas de intestinos de fêmeas de Ae. aegypti alimentadas com açúcar ou sangue. Foi observado que o intestino de fêmeas das três espécies alimentadas com açúcar apresenta um complexo perfil de peptidases ativas, do tipo tripsina, composto por bandas migrando nas regiões entre ~ 24 a 40 kDa e em regiões de alto peso molecular Atividades proteolíticas foram detectadas entre pH 3,5 \2013 10, revelando diferenças quantitativas e qualitativas entre os perfis proteolíticos das três espécies. Em fêmeas de Ae. aegypti, o regime de alimentação com açúcar ou sangue alterou o perfil de SPtrip ativas do intestino de forma qualitativa e quantitativa. Um total de oito tripsinas em Cx. quinquefasciatus e dez tripsinas em An. albitarsis, foram identificadas por SDS-PAGE acoplado a LC-MS/MS. Apesar dessas SPtrip identificadas apresentarem características comuns às tripsinas digestivas de invertebrados, foram observadas diferenças nas sequências de aminoácidos, como por exemplo, em regiões de especificidade ao substrato e de ativação do zimogênio. Foi observado que os genes codificadores para SPtrip possuem diferentes tamanhos e organização, tais como, diferenças no número de éxons/introns. Com relação à composição de proteínas totais solúveis do intestino de fêmeas de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis, análise por LC-MS/MS e bioinformática revelou a presença de proteínas envolvidas em processos fisiológicos importantes, como exopeptidaes, glicosidades, enzimas detoxificantes e proteínas relacionadas com a interação parasito/vetor Em Cx. quinquefasciatus, foram identificadas 1397 proteínas, distribuídas em 1090 grupos, representando um total de ~ 7,5% das proteínas codificadas pelo genoma dessa espécie. Em An. albitarsis foram identificadas 916 proteínas distribuídas em 748 grupos. As centenas de proteínas presentes no intestino de fêmeas alimentadas com açúcar, de ambas as espécies, foram classificadas segundo sua ontologia gênica e o papel de algumas famílias de proteínas historicamente importante em mosquitos foram discutidas. Finalmente, foi demonstrado que abordagem proteômica combinada à enzimografia e bioinformática é uma ferramenta que pode auxiliar na anotação funcional dos genes de tripsinas expressos no intestino de fêmeas alimentadas com açúcar, bem como auxilia no mapeamento do repertório de proteínas totais presentes no intestino de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis
Abstract: Culex quinquefasciatus, Anopheles albitarsis and Aedes aegypti are hematophagous insect from the Culicidae family that feeds on the blood of humans, dogs, birds and livestock. These species transmit a wide variety of pathogens between humans and animals. The midgut environment is the first location of pathogen-vector interaction for blood-feeding mosquitoes and the expression of specific peptidases in the early stages of feeding could influence the outcome of the infection. Trypsin-like serine peptidases belong to a multi-gene family that can be expressed in different isoforms under distinct physiological conditions. However, the confident assignment of the trypsin genes that are expressed under each condition is still a challenge due to the large number of trypsin-coding genes in the Culicidae family and most likely because they are low abundance proteins. We used zymography for the biochemical characterization of the peptidase profile of the midgut from Cx. quinquefasciatus, An. albitarsis, and Ae. aegypti females fed on sugar. We also caracterized the peptidses profile of the midgut from Ae. aegypti fed on blood, during different moments after fedding. Protein samples were also submitted to SDS-PAGE followed by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) analysis for peptidase identification. The peptidases sequences were analyzed by bioinformatics tools to assess their distinct features. Zymography revealed that trypsin-like serine peptidases were responsible for the proteolytic activity in the midgut of females fed on sugar or blood diet. In addition, we observed that the profile is influenced by the blood ingestion. After fractionation in SDS-PAGE, eight and ten trypsin-like serine peptidases were identified by LC-MS/MS in Cx. quinquefasciatus and An. albitarsis, respectively. Peptidases from Cx. quinquefasciatus were also analysed with bioinformatic tools revealing that they have structural features typical of invertebrate digestive trypsin peptidases but exhibited singularities at the protein sequence level such as: the presence of different amino acids at the autocatalytic motif and substrate binding regions as well as different number of disulfide bounds. Data mining revealed a group of trypsin-like serine peptidases that are specific to C. quinquefasciatus when compared to the culicids genomes sequenced so far. We demonstrated that proteomics approaches combined with bioinformatics tools and zymographic analysis can lead to the functional annotation of trypsin-like serine peptidases coding genes and aid in the understanding of the complexity of peptidase expression in mosquitoes.
DeCS: Serina
Tripsina
Culicidae
Aedes
Culex
Anopheles
Cromatografia Líquida
Espectrometria de Massas em Tandem
Issue Date: 2015
Citation: VELOSO, André Borges. Caracterização de serina peptidases e identificação do perfil proteico em intestino de Culex quinquefasciatus, Anopheles albitarsis s.s e Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). 2015. 68 f. Tese (Doutorado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2015.
Date of defense: 2015-Ago-28
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Embargo date: 2016-10-11
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBP - Teses de Doutorado

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