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Title: Frequência gênica dos alelos de HLA classe I e II e sua associação com a resposta imune celular T frente ao antígeno DENV-2 em pacientes infectados pelo vírus dengue
Advisor: Pinto, Luzia Maria de Oliveira
Members of the board: Lima Junior, Josué da Costa
Bonaldo, Myrna Cristina
Oliveira, Juliana Cardoso de
Paes, Marciano Viana
Oliveira, Joanna Reis Santos de
Authors: Silva, Jéssica Badolato Corrêa da
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: O vírus dengue é caracterizado por quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1 a 4), apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas, em que o risco de desenvolvimento das formas graves está parcialmente relacionado com a resposta imune de reatividade cruzada a sorotipos heterólogos. Os alelos do antígeno leucocitário humano (HLA) de classe I e classe II têm sido correlacionados com a susceptibilidade à dengue grave em diferentes populações. Neste estudo, nosso objetivo foi associar a frequência dos alelos do HLA de classe I e II de pacientes com dengue, caracterizados pela infecção por diferentes sorotipos e apresentando diferentes manifestações clínicas, com as frequências de células T produtoras de IL-2, IFN-g e Granzima B, e também com o perfil de ativação destas células em resposta ao antígeno total de DENV-2 (DENV-2 Ag). Utilizamos uma coorte de 60 pacientes naturalmente infectados de diferentes epidemias com prevalência de DENV-1, 2 e 4. Entre os pacientes, 36 deles foram classificados como dengue (FD) e 24 deles como FD com sinais de alerta mais graves (FDSA/Graves) de acordo com a OMS, 2009. A tipagem de alelos de HLA de classe I e II foi realizada utilizando Luminex de múltiplas análises (One Lambda, CA). As células de pacientes foram cultivadas com DENV-2 Ag (isolado de um paciente brasileiro) para a realização dos ensaios de FluoroSpot de IFN-\03B3/IL-2/Granzima B. Em seguida, recuperamos gentilmente as células após a estimulação e realizamos a marcação extracelular com marcadores de ativação (CD45RO, CCR7 e CD62L) por citometria de fluxo. Para as análises estatísticas os testes T pareado, não paramétrico Mann Whitney U, Wilcoxon e as análises com o RATE foram utilizadas Desta forma, a frequência gênica dos HLA classe I mais frequentes em nossa coorte de pacientes DENV+ (>5%) inclui 6 alelos HLA-A (A*02, A*30, A*24, A*03, A*23 e A*01), 7 alelos HLA-B (B*51, B*35, B*44, B*15, B*07, B*58 e B*40), e 7 alelos HLA-C (C*07, C*04, C*03, C*06, C*15, C*08 e C*05). Para o HLA de classe II, 4 alelos HLA-DQA1 (*01, *05, *03 e *02), 5 alelos HLA-DQB1 (*03, *02, *06, *05 e *04) and 8 alelos HLA-DRB1 (*13, *04, *03, *07, *11, *01, *15 e *16). Destes, 2 alelos foram associados com aumento da susceptibilidade (alelo HLA-A*03, p=0.024) ou resistência (alelo HLA-B*15, p=0.034) ao desenvolvimento de FDSA/Grave. Além disso, 6 alelos foram associados com contagem de plaquetas abaixo de 150 mil/mm3 (alelo HLA-B*35, p=0.02, HLA-C*04, p=0.04 e supertipo A03, p=0.003) ou acima de 150 mil/mm3 (HLA-DQA1*02, p=0.033, HLA-DRB1*07, p=0.022 e supertipo A24, p=0.03). Nós demonstramos um aumento de células T produtoras de IFN-\03B3 específicas ao DENV-2 Ag em pacientes FD, mas não em pacientes FDSA/Grave, em comparação com a condição de estímulo basal. No entanto, nenhuma reposta restrita a alelos de HLA foi associada com células produtoras de IFN-\03B3, mas o alelo HLA-C*03 foi associado com células T produtoras de Granzima B após estimulação com DENV-2 Ag. Por fim, também avaliamos a frequencia de subpopulações de linfócitos T A maior parte da resposta de linfócitos T CD4+ após estímulo com DENV-2 Ag foi da subpopulação de linfócitos T CD4 CD45ROposCCR7negCD62Lneg, caracterizado por linfócitos T de memória efetora/efetor. A ausência desta resposta foi associada ao alelo HLA-B*58. Portanto, corroborando estudos anteriores, a expressão de certas moléculas de HLA contribuem com a susceptibilidade ou proteção ao desenvolvimento de formas graves da doença. Além disso, dois dos alelos mais frequentes em nossa coorte de pacientes parecem estar relacionados com uma resposta imune de alta magnitude, e, portanto, uma possível resposta imunoprotetora
Abstract: The dengue virus comprises four antigenically distinct serotypes (DENV-1 to 4), characterized by a broad spectrum of clinical manifestations, in which the risk of developing the severe forms is partially related to the cross-reactive immune responses with heterologous serotypes. Human leukocyte antigen (HLA) class I and class II alleles have been correlated with susceptibility to severe dengue in different populations. In this study, our goal is to associate the HLA class I and II allele frequency from dengue patients, characterized by different serotypes infection and clinical outcomes, with the frequencies of the IL-2, IFN-g and Granzyme B-producing T-cells and also with the profile of activation of these cells in response to DENV-2 antigen. We proceeded in a cohort of 60 naturally infected patients from different epidemics with prevalence of DENV-1, 2 and 4. Among patients, 36 of them classified as dengue fever (DF) and 24 of them as DF with warning signs plus severe (DFWS/S) according to WHO 2009. The profile of HLA class I and II alleles were typed using a Luminex Multi-analyte profiling system (One Lambda, CA). Cells from patients were cultured with DENV-2 Antigen (DENV-2 Ag isolated from a Brazilian patient) for realizing IFN-\03B3/IL-2/Granzyme-B FluoroSpot assays. Then, we gently recovered these cells after stimulation and submitted them to the activation markers (CD45RO, CCR7 and CD62L) extracellular staining by flow cytometry assay The paired t test, nonparametric t test Mann Witney U, Wilcoxon and RATE analysis were used. Briefly, the genotypic frequency of the highly prevalent HLA class I found in our DENV-patients (>5%) included six HLA-A alleles (A*02, A*30, A*24, A*03, A*23 and A*01), seven HLA-B alleles (B*51, B*35, B*44, B*15, B*07, B*58 and B*40), and seven HLA-C alleles (C*07, C*04, C*03, C*06, C*15, C*08 and C*05). For HLA class II, four HLA-DQA1 alleles (*01, *05, *03 and *02), five HLA-DQB1 alleles (*03, *02, *06, *05 and *04) and eight HLA-DRB1 alleles (*13, *04, *03, *07, *11, *01, *15 and *16). These two alleles were associated with increased susceptibility (HLA-A*03 allele, p=0.024) or resistance (HLA-B*15 allele, p=0.034) to DFWS/Severe DENV clinical outcomes. Besides, six alleles were associated with platelets count bellow 150 mil/mm3 (HLA-B*35 allele, p=0.02, HLA-C*04, p=0.04 and supertype A03, p=0.003) or up 150 mil/mm3 (HLA-DQA1*02, p=0.033, HLA-DRB1*07, p=0.022 and supertype A24, p=0.03). We demonstrated an increased DENV Ag-specific IFN-\03B3-producing T cells in DF patients, but not in DFWS/Severe patients, in relation to unstimulated conditions. However, no HLA allele restricted responses were associated with the IFN-g-producing T cells, but HLA-C*03 allele was associated with the granzyme B-producing T cells following DENV-2 Ag stimulation. In the same series of experiment, we also tested the frequency T cells subsets The majority of the CD4+ T-cell responses after DENV-2 Ag stimulation were CD45ROposCCR7negCD62Lneg CD4 T-cells subsets, characterized by effector/effector memory T-cells. This response was mostly associated with HLA-B*58 allele. Therefore, confirming previous studies the expression of certain HLA molecules contribute with susceptibility to or protection from severe clinical outcome. Moreover, two of the most frequent alleles seen in our patients appear to be involved in a higher magnitude of immune response and therefore a more immunoprotective response
DeCS: Linfócitos T
Antígenos HLA
Dengue
Pacientes
Issue Date: 2015
Citation: SILVA, J. B. C. da. Frequência gênica dos alelos de HLA classe I e II e sua associação com a resposta imune celular T frente ao antígeno DENV-2 em pacientes infectados pelo vírus dengue. 2015. 109f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2015
Date of defense: 2015-Dez-17
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBP - Dissertações de Mestrado

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