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Title: Validação de ensaio imunoenzimático (Western blot) para o diagnóstico da histoplasmose
Advisor: Oliveira, Rosely Maria Zancope
Andrade, Carla Lourenço Tavares de
Authors: Almeida, Marcos de Abreu
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: A histoplasmose é uma micose cosmopolita causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum, cujo habitat é o solo rico em excretas de aves e morcegos. Esta infecção ocorre a partir da inalação de propágulos de H. capsulatum e apresenta um amplo espectro clínico, variando de formas leves a disseminadas, a depender do inóculo infectante, do status imunológico do hospedeiro e da virulência da cepa. O diagnóstico da histoplasmose é baseado em aspectos clínicos, epidemiológicos, radiológicos e laboratoriais, embora alguns sintomas possam ser confundidos com outras doenças, tais como a tuberculose e outras micoses. O teste de referência para a confirmação do diagnóstico é o isolamento e identificação de H. capsulatum em cultivo. Entretanto, na ausência dos mesmos, a sorologia tem sido utilizada para o diagnóstico presuntivo da histoplasmose através da detecção de anticorpos. O principal complexo antigênico utilizado para a detecção de anticorpos anti-H. capsulatum é a histoplasmina, constituída principalmente pelos antígenos C, H e M. Estes últimos, em sua forma nativa, são glicoproteínas contendo epítopos protéicos específicos e glicosídicos inespecíficos. Deglicosilações químicas pelo metaperiodato de sódio (NaIO4) provaram aumentar a sensibilidade e especificidade em métodos imunoenzimáticos, tais como Western blot e ELISA, reduzindo a reatividade cruzada com outros fungos O principal objetivo do presente estudo foi validar o método imunoenzimático (Western blot) para a detecção de anticorpos no diagnóstico da histoplasmose. Desta forma, foi realizado um estudo casocontrole, utilizando 118 amostras de soro de pacientes com histoplasmose e 118 amostras de soro de indivíduos com história clínico-epidemiológica compatível com micose sistêmica, saudáveis ou acometidos por outra micose ou tuberculose, residentes no estado do Rio de Janeiro. As amostras foram coletadas no período de 2000 a 2013 e encaminhadas ao Laboratório de Micologia do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Os parâmetros de validação diagnóstica foram calculados considerando a categorização dos resultados obtidos em uma tabela 2 X 2 e analisados pelo SPSS 17.0. O Western blot demonstrou uma sensibilidade de 94,9%, especificidade de 94,1%, acurácia de 94,5% e uma precisão quase perfeita. As fitas demonstraram-se viáveis para utilização por até cinco anos após a sensibilização com o antígeno HMIN-PT. Estes resultados comprovam a validade do ensaio imunoenzimático (Western blot) para detecção de anticorpos anti-H. capsulatum utilizando HMIN-PT como uma ferramenta de boa acurácia no diagnóstico da histoplasmose e reprodutível. Desta forma, contribuindo para o melhoramento do diagnóstico desta micose, uma vez que esta técnica permitirá a obtenção de resultados em menos de 24 horas, o que supõe um grande avanço a despeito das técnicas existentes na atualidade e poderá vir a ser implantada e disponibilizada para outros centros do Sistema Único de Saúde.
Abstract: Histoplasmosis is a worldwide systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum. The fungus lives in soil that contains large amounts of birds or bats droppings. This infection occurs through inhalation of spores of H. capsulatum and has a wide clinical spectrum, ranging from mild to disseminated forms that depend on the infecting inoculum, the immune status of the host and the virulence of the strain. The diagnosis of histoplasmosis is based on clinical, epidemiological, radiological and laboratory aspects; however, some symptoms may be confused with other diseases, such as tuberculosis and other mycoses. The reference test for the confirmation of the diagnosis of histoplasmosis is the isolation and identification of H. capsulatum in culture. However, in the absence of it, serology has been used for the presumptive diagnosis of histoplasmosis through antibody detection. The principal antigenic complex used to detect antibodies anti-H. capsulatum is the histoplasmin, consisting mainly of antigens C, H and M. These antigens, in their native forms, are glycoproteins containing specie-specific protein epitopes and non-specific glycosides. Chemical deglycosylations by sodium metaperiodate (NaIO4) have shown to increase the sensitivity and specificity of immunoenzymatic methods, such as Western blot and ELISA, reducing cross-reactivity with other fungi. The aim of this study was to validate the immunoassay method (Western blot) to detect antibodies in the diagnosis of histoplasmosis Therefore, a case-control study was conducted using 118 serum samples from patients with histoplasmosis, and 118 serum samples from individuals with clinical and epidemiological history compatible with systemic mycosis, either healthy or suffering from other mycosis or tuberculosis. These patients were residents in the state of Rio de Janeiro and the samples, collected from 2000 to 2013, were sent to the Mycology Laboratory of the Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Diagnostic validation parameters were calculated based on the categorization of results obtained in a 2 x 2 table and analyzed using SPSS Statistics 17.0. The Western blot was shown sensitivity of 94.9%, specificity of 94.1%, accuracy of 94.5% and also almost perfect precision. Besides, the strips have been proved to be viable for use or at least five years after the sensitization with antigen HMIN-PT. These results prove the validity of the enzyme immunoassay (Western blot) for the detection of antibodies anti-H. capsulatum, using HMIN-PT as a good accuracy tool in the diagnosis of histoplasmosis and reproducible, contributing to improve the diagnosis of this mycosis, since this technique allows obtaining results in less than 24 hours which implies a breakthrough despite existing at present and will eventually be deployed and made available to other centers belonging to the Public Health System
DeCS: Histoplasmose
Testes Imunológicos
Western Blotting
Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
Issue Date: 2014
Citation: ALMEIDA, M. de A. Validação de ensaio imunoenzimático (Western blot) para o diagnóstico da histoplasmose. 2014. 97f.Dissertação (Mestrado em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas)-Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, RJ, 2014
Date of defense: 2014
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas
Copyright: open access
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