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Title: Caracterização do potencial diagnóstico de poliantígenos para detecção do Trypanosoma cruzi na fase crônica da doença de Chagas
Other Titles: Chracterization of the potencial diagnostic of polyantignes for detecting Trypanosoma cruzi in the chronic phase of Chagas disease
Advisor: Gomes, Yara de Miranda
Members of the board: Gomes, Yara de Miranda
Dhália, Rafael
Schindler, Haiana Charifker
Almeida, Alzira Maria Paiva de
Rocha, Abraham Cézar de Brito
Authors: Santos, Fred Luciano Neves
Coadvisor: Krieger, Marco Aurélio
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil
Abstract: O diagnóstico da doença de Chagas crônica (DCC) baseia-se em metodologias que usam em sua fase sólida antígenos brutos, semipurificados ou recombinantes, podendo resultar em baixa sensibilidade ou reação cruzada. Uma forma para resolver este problema é o uso de quimeras formadas por epítopos conservados e repetitivos de diferentes estruturas parasitárias em uma única molécula. O nosso objetivo foi caracterizar e avaliar o uso de quimeras em imunoensaios para o diagnóstico da DCC. As quimeras, IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4 foram purificadas por meio de cromatografia e sua pureza avaliada por SDSPAGE. Ensaios de dicroísmo circular (DC) e espalhamento dinâmico da luz (EDL) foram usados para avaliação do raio hidrodinâmico das quimeras, avaliação de sua estabilidade e escolha do sistema tampão que oferecesse o menor estado de agregação molecular. Ensaios sorológicos para detecção de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi através de ELISA foram realizados utilizando um painel de 857 amostras positivas para a DCC e 689 negativas. Para avaliação de reação cruzada foram usadas 1079 amostras de diversas doenças endêmicas no país. A purificação foi eficiente uma vez que o SDS-PAGE indicou ausência de degradação das quimeras. As análises de DC e EDL mostraram que as quatro quimeras apresentaram menor tendência de agregação em tampão carbonato pH 9,6, sendo, assim, este o sistema para a sensibilização das placas. Os ensaios sorológicos revelaram valores elevados de sensibilidade (Sen) e especificidade (Esp) para a molécula IBMP-8.4 (Sen-99,3%; Esp-100%). O desempenho para as demais moléculas foi satisfatório, ficando os valores de Sen e Esp acima de 94%. As moléculas IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4 apresentaram respectivamente 0,46%, 0,85%, 0,46% e 0,37% de reação cruzada. Os resultados apontam que as quimeras atingiram os critérios de proficiência do Ministério da Saúde podendo, dessa forma, ser utilizados em ensaios diagnósticos para a DCC.
Abstract: Chronic Chagas disease (CCD) diagnosis is based on serological methods employing crude, semipurified or recombinant antigens, which eventually may result in low sensitivity or crossreactivity. An alternative method for solving this problem is the use of chimeric molecules composed by conserved and repetitive epitopes of distinct parasite structures. Our objective was to evaluate the use of chimeras in immunoassays for the diagnosis of CCD. The chimeras IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 and IBMP-8.4 were purified by chromatography and their purity assessed by SDS-PAGE. Circular dichroism (CD) and dynamic light scattering (DLS) were used to assess the hydrodynamic radius of the chimeras, to evaluate their stability and to select the buffering system that offers the lowest state of molecular aggregation. Serological tests for detection of anti-Trypanosoma cruzi were performed by ELISA using a panel of 857 positive and 689 negative serum samples for CCD. Cross-reactivity was assessed by using 1079 serum samples from patients with unrelated diseases. The purification was efficient since SDS-PAGE indicated the absence of degradation of chimeric proteins. Analyses of CD and DLS showed that the four chimeras had low aggregation tendency in carbonate buffer, pH 9.6. Serological testing showed high values of sensitivity (Sen) and specificity (Spe) for IBMP-8.4 (Sen-99.3%; Spe-100%). The performance of other molecules was satisfactory, being the Sen and Spe values above 94%. Cross-reaction was observed in 0.46%, 0.85%, 0.46% and 0.37% of the samples tested against IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 and IBMP- 8.4, respectively. The results indicate that the chimeras reached the Brazilian Ministry of Health proficiency criteria and may thus be used in diagnostic assays for CCD.
keywords: Doença de Chagas
Testes Sorológicos
Quimera
Reações antígeno-anticorpo
DeCS: Doença de Chagas/imunologia
Doença de Chagas/diagnóstico
Doença Crônica
Trypanosoma cruzi/imunologia
Quimera
Reações Antígeno-Anticorpo
Testes sorológicos
Antígenos de Protozoários/análise
Ensaio de Imunoadsorção Enzimática/métodos
Sensibilidade e Especificidade
Valor Preditivo dos Testes
Issue Date: 2016
Publisher: Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
Citation: SANTOS, Fred Luciano Neves. Caracterização do potencial diagnóstico de poliantígenos para detecção do Trypanosoma cruzi na fase crônica da doença de Chagas. 2016. 197 f. Tese (Doutorado em em Biociências e Biotecnologia em Saúde), Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Recife, PE, 2016.
Date of defense: Março 18, 2016
Place of defense: Recife/PE
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
Program: Programa de Pós-Graduação em Saúde Pública
Copyright: open access
Appears in Collections:PE - IAM - PPBBS - Teses de Doutorado

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