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Title: Caracterização de TcRBSR1 em Trypanosoma Cruzi
Advisor: Alves, Lysangela Ronalte
Members of the board: Avila, Andrea Rodrigues
Authors: Malgarin, Juliane Soldi
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas que afeta milhões de pessoas no mundo. A regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos se dá majoritariamente a nível póstranscricional diferindo daquela de outros eucariotos. Apesar de demonstrada a mobilização diferencial de mRNAs em T. cruzi e a importância da regulação pós-transcricional, poucas proteínas de ligação ao RNA foram caracterizadas até o momento. O domínio RNA Recognition Motif (RRM) de ligação ao RNA é um dos mais abundantes domínios encontrados em proteínas de ligação a RNA (RBPs). Proteínas com esse domínio RRM estão envolvidas na maioria dos processos póstranscricionais. RBPs associadas a moléculas de mRNA e outras proteínas regulatórias formam os complexos ribonucleoproteicos (mRNPs), que estão envolvidos na regulação do RNA. Nesse trabalho, reportamos a caracterização de uma proteína de ligação a mRNAs que apresenta domínio RRM, denominada RBSR1. A proteína foi fusionada a uma etiqueta TAP-tagging N-terminal (RBSR1TAP tagging) e os experimentos foram realizados com parasitas transfectados. Ensaios de imunofluorescência, para determinar a localização da proteína, mostraram que a proteína apresenta um padrão de migração entre o núcleo e o citoplasma em diferentes etapas da diferenciação do parasita e que sua expressão é regulada ao longo do ciclo de vida, não sendo expressa em tripomastigotas metacíclicos. O ensaio também foi realizado sob condições de estresse e demonstrou-se a mudança de localização da proteína RBSR1 quando submetida a estresse nutricional e oxidativo. O perfil de polissomos em gradiente de sacarose mostrou que RBSR1, tanto em epimastigotas, quanto sob estresse nutricional, está relacionada a complexos ribonucleoproteicos pesados não associados à tradução. Foram realizados ensaios de imunoprecipitação para identificação dos mRNAs alvos da proteína, seguido de sequenciamento massivo, onde observou-se transcritos que codificam para proteínas ribossomais e também proteínas hipotéticas. Também foi realizada a identificação de proteínas parceiras a RBSR1 por imunoprecipitação de formas epimastigotas em fase exponencial de crescimento e sob estresse nutricional, seguida de espectrometria de massas. Em epimastigotas em crescimento exponencial foram identificadas 86 proteínas parceiras e sob estresse nutricional 31 proteínas, observou-se alta heterogeneidade das parceiras, a qual pode ser explicada pela mobilidade apresentada por RBSR1 nas diversas formas do parasita. Adicionalmente, foram vistas várias proteínas que se associam a grânulos de RNA, como por exemplo DHH1 e HSP70, e dessa forma é possível que haja a associação de RBSR1 com esses grânulos. O estudo do papel das RBPs na modulação da expressão gênica em tripanossomatídeos pode pavimentar o caminho para o desenvolvimento de novas estratégias para combater as doenças causadas por esses organismos e ajudar a elucidar sua biologia.
Abstract: Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease, a neglected disorder that affects millions of people around the world. Gene regulation is mainly post-transcriptional in trypanosomatids differing from other eukaryotes. Although the differential mobilization of mRNAs has been demonstrated in T. cruzi and despite the importance of post-transcriptional regulation in these organisms, just a few RNA binding proteins have been characterized so far. The RNA Recognition Motif (RRM) is the most important and most common domain in RNA binding proteins (RBPs). Proteins with this domain are involved in the majority of the post-transcriptional processes. RBPs associate with mRNA molecules and other regulatory proteins, forming ribonucleoprotein (mRNP) complexes, which are involved in several levels of RNA regulation. Here, we report the characterization of RBSR1, an RNA binding protein with RRM domain. The protein was tagged with TAP-tagging label and the assays were performed with transfected parasites (RBSR1-TAP tagging). Immunofluorescence assays to determine the localization of protein showed that it shifts from the nucleus to the cytoplasm throughout the parasite’s differentiation and was regulated as is not expressed in metacyclic trypomastigotes. The assay was also performed under stress conditions and confirmed that changes the localization of RBSR1 when the parasites are under nutritional and oxidative stress conditions. The polysome profile in sucrose gradients showed that TcRBSR1 is associated with heavy ribonucleoprotein complexes not associated to translation. Immunoprecipitation assays were performed to identify the mRNA targets associated to the protein through next generation sequencing. Furthermore, identification of RBSR1 partners was made by mass spectrometry analysis of proteins immunoprecipitated from epimastigotes 3 days and under nutritional stress conditions. The data indicated that, 86 partners were identified in epimastigotes 3 days whereas 31 partners of RBSR1 under nutritional stress conditions. It was observed a high heterogeneity of the partners of RBSR1, which might be explained by the mobility of RBSR1 between nucleus and cytoplasm in different forms of parasite. Among the proteins associated to RBSR1 there were proteins that associate with RNA granules, as DHH1 and HSP70. Hence it is likely that RBSR1 also associates with RNA granules. The study of the role of RBPs in modulating gene expression in trypanosomatids might pave the way to the development of new strategies to tackling the diseases caused by these organisms and help to elucidate their biology.
Keywords: Trypanosoma Cruzi
Chagas disease
Post-transcriptional regulation
RNA binding protein
RNA Recognition Motif
keywords: Trypanosoma cruzi
Doença de Chagas
Regulação pós-transcricional
Proteína ligadora a RNA
Domínio de reconhecimento a RNA
Issue Date: 2015
Citation: MALGARIN, Juliane Soldi. Caracterização de TcRBSR1 em Trypanosoma Cruzi. 2015. 92 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, 2015.
Date of defense: 2015-02-25
Place of defense: Curitiba/PR
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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