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Title: Estudo da participação de Clatrina no tráfego intracelular de vesículas em Trypanosoma Cruzi
Advisor: Soares, Maurilio Jose
Members of the board: Gradia, Daniela Fiori
Silva, Narcisa Leal da Cunha e
Rocha, Wanderson Duarte da
Authors: Kalb, Ligia Cristina
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: O tráfego vesicular mediado por clatrina, mecanismo pelo qual proteínas e lipídeos são transportados entre organelas envolvidas por membrana, é responsável por uma grande proporção de interiorização de membrana plasmática (endocitose) e de transporte a partir da Rede Trans Golgi para o sistema endossomal. Os eventos mediados por clatrina ainda são pouco conhecidos no protozoário Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas na América Latina. Além disso, estudos de sequências genômicas demonstram um extremo grau de divergência entre tripanosomatídeos, animais e fungos, com cerca de 1/3 das proteínas preditas sem função conhecida. Neste estudo, a expressão do gene e a localização das proteínas cadeias pesada (TcCHC) e leve (TcCLC) de clatrina foram investigadas em diferentes formas evolutivas de T. cruzi (epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas), utilizando anticorpos policlonais e monoclonais produzidos contra as proteínas recombinantes de T. cruzi. A localização celular da proteína epsina (TcEpsina), uma importante proteína associada à clatrina, também foi investigada através de sua fusão com GFP e subsequente imunolocalização. Análise por microscopia confocal revelou um acúmulo de TcEpsina, TcCHC e TcCLC na porção anterior das células, onde a bolsa flagelar e complexo de Golgi estão localizados. A TcCLC parcialmente colocalizou com o marcador de Golgi TcRAB7-GFP e com albumina endocitada, mas não co-localizou com transferrina, uma proteína endocitada principalmente via vesículas não revestidas formadas no complexo citóstoma/citofaringe. As cadeias leve e pesada de clatrina tipicamente localizaram-se na porção anterior ao cinetoplasto, região em que encontram-se a bolsa flagelar e o Complexo de Golgi. Nossos dados indicam que em formas epimastigotas de T. cruzi a endocitose de albumina mediada por clatrina ocorre na bolsa flagelar, enquanto endocitose de transferina independente de clatrina ocorre no complexo citóstoma/citofaringe. Para uma análise proteômica dos complexos proteicos associados à clatrina e epsina, a cadeia leve de clatrina foi fusionada às proteínas A e C e a epsina foi fusionada a GFP e ambas as proteínas foram submetidas à criomoagem seguida da imunoprecipitação dos complexos a elas associados. Esta metodologia permitiu a identificação de suas proteínas associadas por espectrometria de massas, tais como os Complexos Adaptadores AP-1 e AP-4, vSNAREs, Rab4, Rab 11, epsina, tepsina, AP180, Sec1, Auxilina e Scamp. Foi demonstrada também a presença de proteínas hipotéticas nesta análise. Esta metodologia nos permitiu sugerir a forma com a qual ocorre o tráfego de vesículas em T. cruzi e como ocorre a maturação dos reservossomos, os quais acumulam funções de endossomo inicial, endossomo tardio e lisossomo. Análises futuras são necessárias a fim de comprovar estas hipóteses.
Abstract: The vesicular traffic mediated by clathrin - mechanism by which proteins and lipids are transported between membrane bound organelles - is responsible for a large proportion of internalization of plasma membrane (endocytosis) and transport from the Golgi Network Trans to the endosomal system. Clathrin-mediated events are not well known in Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease in Latin America. In addition, studies of genome sequences show an extreme degree of divergence between trypanosomatids, animals and fungi, with about 1/3 of the predicted proteins with unknown function. In this study, gene expression and protein localization of the clathrin heavy (TcCHC) and light (TcCLC) chains were investigated in different T. cruzi developmental forms (epimastigotes, trypomastigotes and amastigotes), using polyclonal and monoclonal antibodies produced against T. cruzi recombinant proteins. Cellular localization of epsin (TcEpsin), an important protein associated with clathrin, was investigated through its fusion with GFP and subsequent immunolocalization. Analysis by confocal microscopy revealed an accumulation of TcEpsin, TcCHC and TcCLC in the anterior portion of the cells, where the flagellar pocket and Golgi complex are located. TcCLC partially co-localized with the Golgi marker TcRAB7-GFP and ingested albumin, but not co-located with transferrin, a protein endocytosed mainly via uncoated vesicles formed in the cytostome/cytopharynx complex. The clathrin light and heavy chains typically located at the anterior region of the kinetoplast and flagellar pocket, close to the Golgi apparatus. Our data indicate that in T. cruzi epimastigotes clathrin mediated endocytosis of albumin occurs in the flagellar pocket, while clathrin independent endocytosis of transferrin occurs in the cytostome/cytopharynx complex. For proteomics analysis of protein complexes associated with clathrin and epsin, the clathrin light chain was fused to proteins A and C and epsin was fused to GFP. Both proteins were then subjected to cryogrinding followed by immunoprecipitation of associated complexes. This methodology allowed the identification of associated proteins by mass spectrometry, such Adaptor Complexes AP-1 and AP-4, vSNAREs, Rab4, Rab11, epsin, tepsin, AP180, Auxilin and Scamp. Putative proteins were also demonstrated in this analysis. This methodology allowed us to suggest the way by which the vesicular traffic and the maturation of reservosomes occurs in T. cruzi. Reservosomes may accumulate functions of early endosome, late endosome and lysosome. Further analyzes are needed to confirm these hypothesis.
Keywords: Intracellular Vesicle Traffic
Clathrin
Trypanosoma cruzi
keywords: Tráfego Intracelular de Vesículas
Clatrina
Trypanosoma Cruzi
Issue Date: 2015
Citation: SOUZA, Ligia Cristina Kalb. Estudo da participação de clatrina no tráfego intracelular de vesículas em Trypanosoma cruzi. Curitiba, 2015. 101 f. Tese (Doutorado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, 2015.
Date of defense: 2015-04-23
Place of defense: Instituto Carlos Chagas
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz.
Program: Biociências e Biotecnologia (31010016025P6)
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Teses de Doutorado

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