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Title: Estudo do Efeito Inibitório de óleos Essenciais de Pimenta de Macaco e Pimenta Longa contra Trypanossoma Cruzi
Advisor: Soares, Maurilio José
Members of the board: Eger, Iriane
Cardoso, Josiane
Wowk, Pryscilla Fanini
Authors: Silva, Luz Helena Villamizar
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: A presente dissertação teve por objetivo avaliar o potencial tripanocida in vitro dos óleos essenciais (OEs) de Piper hispidinervum (pimenta longa) e Piper aduncum (pimenta de macaco) sobre diferentes formas evolutivas de Trypanosoma cruzi clone Dm28c (epimastigotas; amastigotas intracelulares; tripomastigotas metacíclicas e de cultivo). O OE de pimenta longa é rico em safrol e demonstrou baixa atividade contra T. cruzi (IC50/24h>100 μg/ml para formas epimastigotas e tripomastigotas) e leve citotoxicidade contra células Vero. O OE de pimenta de macaco foi efetivo contra formas epimastigotas (IC50/24h=84,74 μg/ml), sendo porém mais eficaz contra formas tripomastigotas metacíclicas (12,1 μg/ml) e de cultura a 28°C (2,8 μg/ml). Os valores obtidos com formas tripomastigotas foram melhores do que os obtidos com a droga de referência benzonidazol a 28°C (IC50/24h=16,1 μg/ml). Entretanto, contra formas amastigotas o benzonidazol foi mais ativo que o OE de pimenta de macaco (IC50/24h=0,8 μg/ml e 9 μg/ml respectivamente). Testes realizados com tripomastigotas de cultura a 4°C (mesma condição térmica de armazenamento de bolsas de sangue) demonstraram alta atividade do OE de pimenta de macaco (IC50/24h = 3,8 μg/ml), em comparação com os resultados obtidos com a droga de referência violeta de genciana (IC50/24h=60,7 μg/ml). Avaliação da citotoxicidade do OE de pimenta de macaco contra células Vero a 37°C (CC50/24h=42,8 μg/ml) e hemácias a 4°C (CC50/24h=351,6 μg/ml) demonstrou um alto índice de seletividade (IS) contra tripomastigotas (11,26 e 92,52, respectivamente). Estes índices sugerem que o OE de pimenta de macaco não é um candidato favorável para pacientes chagásicos, mas sim um composto promissor para tratamento de bolsas de sangue. Ensaios por citometria de fluxo evidenciaram que o OE de pimenta de macaco não afeta o ciclo celular de formas epimastigotas, mas inibe consideravelmente o potencial da membrana mitocondrial destas formas. Análise por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou que tratamento de tripomastigotas com 3,8 μg/ml (correspondente ao IC50/24h) produz danos ultra-estruturais como lise de membranas e perda de citoplasma. Análise por Cromatografia de Gases e Espectroscopia de Massas (CG-EM) demonstrou que os constituintes majoritários do OE de pimenta de macaco são nerolidol e linalol (25% e 13,42% respectivamente). Testes com tripomastigotas de cultura a 4°C demonstraram que nem sempre o constituinte majoritário de um OE é o mais eficiente como tripanocida, pois linalol apresentou melhor efeito tripanocida (IC50/24h=306 ng/ml) que nerolidol, o qual não induziu alterações visíveis por microscopia óptica. Nossos dados indicam que linalol é um composto promissor contra tripomastigotas, pois foi 168,6 vezes mais eficiente que benzonidazol em testes com formas tripomastigotas de cultura. Em conclusão, as propriedades tripanocidas do OE da pimenta de macaco e seu constituinte linalol devem ser estudadas mais aprofundadamente, especialmente devido à sua seletividade contra tripomastigotas de cultura. Linalol surge como um potencial candidato a uma droga para aplicação em tratamento de bolsas de sangue.
Abstract: The protozoan Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease, a neglected tropical disease endemic in 18 countries in Latin America. There is no effective treatment for this disease, which affects about 7-8 million people in the world. In the search for a natural alternative compound, this dissertation aimed to evaluate the trypanocidal potential of essential oils (EOs) of Piper hispidinervum (long pepper) and Piper aduncum (jack pepper) in vitro against different evolutive forms of Trypanosoma cruzi clone Dm28c (epimastigotes; intracellular amastigotes, metacyclic and cell derived trypomastigotes). The long pepper OE is rich in safrole and showed low activity against T. cruzi (IC50/24h>100 µg/ml for epimastigotes and trypomastigotes) and mild cytotoxicity against Vero cells. The jack pepper EO was effective against epimastigotes (IC50/24h = 84.74 μg/ml), but was more effective against metacyclic (12.1 μg/ml) and cell derived (2.8 μg/ml) trypomastigotes at 28°C. The values obtained with trypomastigotes were much better than those obtained with the reference drug benznidazole at 28°C (IC50/24h = 16.1 μg/ml). However, benznidazole against amastigotes was more active than the jack pepper EO (IC50/24h=0.8 μg/ml and 9 μg/ml, respectively). Tests performed with cell derived trypomastigotes at 4°C (same thermal condition to stock blood) showed high activity of the jack pepper EO (IC50/24h = 3.8 μg/ml) as compared to the results obtained with the reference drug gentian violet (IC50/24h = 60.7 μg/mL). Evaluation of the jack pepper EO cytotoxicity against Vero cells at 37°C (CC50/24hr = 42.8 μg/ml) and red blood cells at 4°C (CC50/24h = 351.6 μg/ml) showed a high selectivity index (SI) against trypomastigotes (11.26 and 92.52, respectively). These indexes suggest that the jack pepper EO is not a good candidate for treatment of chagasic patients, but is a promising compound for treating blood bags. Flow cytometry assays showed that jack pepper EO does not affect the cell cycle of epimastigotes, but significantly inhibits the mitochondrial membrane potential of these forms. Analysis by transmission electron microscopy showed that treatment of trypomastigotes with 3.8 μg/ml (IC50/24h value) produced ultrastructural damage such as membrane lysis and loss of cytoplasm. Analysis by Gas Chromatography and Mass Spectroscopy (GC-MS) showed that the major constituents of jack pepper EO are nerolidol and linalool (25% and 13.42%, respectively). Tests with culture trypomastigotes at 4°C showed that not always the EO major constituent is more efficient as a trypanocidal drug, as linalool showed better trypanocidal effect (IC50/24h = 306 ng/ml) than nerolidol, which induced no visible changes as assessed by light microscopy. Our data indicate that linalool is a promising compound against trypomastigotes, because it was 168.6 times more efficient than benznidazole in tests with cell derived trypomastigotes. In conclusion, the trypanocidal properties of jack pepper EO and its major constituent linalool should be further studied, especially because of their selectivity against cell derived trypomastigotes. Linalool appears as a potential candidate for a drug for use in the treatment of blood bags.
Keywords: Peppers
Essential oil
Trypanosoma cruzi
Trypanocidal activity
Chagas disease
keywords: Pimentas
Óleo essencial
Linalol
Trypanosoma cruzi
Atividade tripanocida
Doença de Chagas
Issue Date: 2015
Citation: SILVA, Luz Helena Villamizar. Estudo do Efeito Inibitório de óleos Essenciais de Pimenta de Macaco e Pimenta Longa contra Trypanossoma Cruzi. 2015. 79 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, 2015.
Date of defense: 2015-02-27
Place of defense: Curitiba/PR
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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