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Title: Caracterização molecular de Klebsiella pneumoniae produtoras de carbapenemases do tipo KPC-2, NDM-1 e OXA-370 isoladas no Brasil
Advisor: Assef, Ana Paula D'Alincourt Carvalho
Members of the board: Santos, Leticia Miranda Lery
Leão, Robson de Souza
Picão, Renata Cristina
Albano, Rodolpho Mattos
Silva, Deys e Christina Vallim da
Authors: Pereira, Polyana Silva
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: Klebsiella pneumoniae multirresistentes produtoras de carbapenemases do tipo KPC, NDM e OXA-48-like envolvidas em infeções hospitalares são atualmente um grande problema de saúde pública em diferentes partes do mundo. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi realizar a caracterização molecular de 66 amostras de Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC, NDM e OXA-48-like provenientes de diferentes estados brasileiros, obtidas de diferentes materiais clínicos, no período entre 2010 a 2014. A confirmação da produção de carbapenemases, identificação da variante alélica e avaliação do ambiente genético foram realizadas por PCR e sequenciamento. A susceptibilidade aos antimicrobianos foi determinada através de difusão em ágar (CLSI, 2015) e determinação da CIM por Etest® (Nota Técnica N°1/2013 ANVISA). Foi realizada pesquisa através de PCR para genes de resistência a beta-lactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas, bem como pesquisa de genes de virulência. Para análise epidemiológica, PFGE e MLST foram utilizados. A identificação do plasmídio carreador do gene codificador de carbepenemases foi realizada através de extração plasmidial e hibridização. O sequenciamento genômico foi realizado em 11 amostras selecionadas para investigação da presença e o ambiente genético de genes de resistência, genes de virulência, bem como realização de análise da relação filogenética entre as amostras estudadas. As variantes genéticas dos genes codificadores de carbapenemases foram blaKPC-2, blaNDM-1 e blaOXA-370. Observamos o fenótipo de multirresistência em todas as amostras incluídas no estudo, sendo dez amostras resistentes a oito das nove classes de antimicrobianos testadas Genes adquiridos codificadores de resistência a beta-lactâmicos, aminoglicosídeos, quinolonas, fosfomicinas, sulfonamidas, macrolídeos, fenicóis, tetraciclinas, rifampicinas e trimetoprima foram encontrados através de PCR e sequenciamento genômico. Além dos genes de resistência adquiridos, observamos mutações em genes relacionados à resistência a quinolonas (gyrA, parC, parE, oqxR), tigeciclina (ramR e acrR), e mutações nas porinas OmpK35 e OmpK36 através do sequenciamento genômico, demonstrando o grande aresenal e a grande capacidade de aquisição de diferentes mecanismos de resistência entre as amostras. Não observamos, através do PCR ou sequenciamento genômico, os principais fatores de virulência associados às amostras hipervirulentas, como magA (wzyKPK1), rmpA, rmpA2, sendo detectados na maioria das amostras genes associados à adesão e sobrevivência bacteriana, como produção de fimbrias e adesinas (mrkD = 96,9%; fimH=100%; ycfm = 100%) e transporte de sideróforos (entB=100%). Nas amostras positivas para blaKPC-2 encontramos a estrutura completa do Tn4401 isoforma b em 84,3% das amostras. Observamos o gene blaKPC-2 associado a um mesmo plasmídio de 40kb em 41,9% das amostras, que apresentou estrutura genética similar a um plasmídio já descrito na literatura. Nas amostras positivas para blaNDM-1 observamos, em todas, a associação do gene blaNDM-1 com ISAba125 e bleMBL, e através do sequenciamento genômico, observamos a estrutura completa do Tn3000. O gene blaOXA-370 foi encontrado em plasmídios de 25kb (duas amostras), 50 kb e 117kb, sendo observado flanqueado upstream por uma transposase Tn3 truncada por IS5075-like e downstream por uma transposase Tn4 truncada por IS15-like nas amostras sequenciadas Observamos 30 grupos clonais por PFGE e 27 sequence types, com destaque para os grupos KPC_A/ST437; KPC_C/ST11 e KPC_Q/ST340 nas amostras positivas para blaKPC-2, pertencentes ao Complexo Clonal 11 (CC11), mundialmente associado à dispersão dessa carbapenemase. Nas amostras positivas para blaNDM-1 e blaOXA-370 os grupos clonais mais observados foram NDM_A/ST37 (41,6%) e OXA-370_A/ST16 (95,4%) respectivamente. A análise filogenética a partir do genoma corroborou os agrupamentos realizados através de MLST. Principalmente nas amostras do CC11 positivas para blaKPC-2 e nas amostras do ST16 positivas para blaOXA-370 observamos o acúmulo de mutações associadas a genes de resistência e nas porinas. Acreditamos que estas mutações podem contribuir para o fenótipo de resistência e consequentemente, auxiliar no sucesso desses clones prevalentes. Este estudo alerta para a presença de amostras multirresistentes produtoras de carbapenemases em nosso país carreando um grande arsenal de genes de resistência adquirida associados a elementos genéticos moveis, mas também apresentando mutações associadas à resistência e carreando alguns genes de virulência, fato preocupante devido às limitações para tratamento
Abstract: Multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae producing KPC, NDM or OXA-48-like carbapenemases involved in hospital infections are currently one of the major public health problems in different parts of the world. Thus, the aim of this study was to perform molecular characterization of 66 KPC, NDM and OXA- 48-like producing Klebsiella pneumoniae from different Brazilian states, obtained from different clinical specimens between 2010 and 2014. Confirmation of carbapenemases production, identification of the allelic variant and the genetic environment of the carbapenemase gene was evaluated by PCR and sequencing. The antimicrobial susceptibility was determined by agar diffusion (CLSI, 2015) and MIC determination by Etest® (Technical Note No.1/2013 ANVISA). We searched for resistance genes to betalactams, aminoglycosides, quinolones, as well as virulence genes by PCR. For epidemiological analysis, PFGE and MLST were used. The identification of the plasmid carrying the carbapenemase gene was performed by plasmid extraction and hybridization. Genomic sequencing was conducted on 11 samples selected in order to investigate the presence and the genetic environment of resistance genes, virulence genes and performing phylogenetic analysis. Genetic variants of genes encoding carbapenemases were blaKPC-2, blaNDM-1 and blaOXA-370. We observed the multidrug resistance phenotype in all strains, being ten samples resistant to eight of the nine classes of antimicrobials tested Applying PCR and genomic sequencing, we observed acquired resistance genes to beta-lactams, aminoglycosides, quinolones, fosfomycins, sulfonamides, macrolides, phenicols, tetracyclines, trimethoprim, rifampicin. In addition to the acquired resistance genes, we found mutations in genes related to resistance to quinolones (gyrA, parC, parE, oqxR), tigecycline (ramR e acrR), and mutations in porins OmpK35 and OmpK36, demonstrating the great aresenal and great ability to acquire different resistance mechanisms between samples. We did not observe through PCR and genome sequencing the major virulence factors associated with hypervirulent K .pneumoniae clones, such as magA (wzyKPK1), rmpA, rmpA2, being detected in most samples genes associated with adherence and bacterial survival, as production of fimbriae and adhesins (mrkD = 96,9%; fimH=100%; ycfm = 100%) and siderophores (entB=100%). In KPC-2 producing strains we observed the complete structure of Tn4401 b in 84.3% of samples. This gene was associated to a single plasmid of 40kb in 41.9% of the samples, which showed a similar genetic structure to a plasmid previously described in São Paulo. blaNDM-1 gene was associated to ISAba125 and bleMBL in all strains, and by genomic sequencing, we found the complete structure of Tn3000. The blaOXA-370 gene was found on plasmids 25kb (two samples), 50kb and 117kb and in the samples selected for genome analysis, this gene was observed flanked upstream by a transposase Tn3 truncated by a IS5075-like and downstream by a transposase Tn4 truncated by one IS15-like We observed 30 clonal groups by PFGE and 27 sequence types, being KPC_A/ST437; KPC_C/ST11 and KPC_Q/ST340 the most important. These sequence types belongs to CC11, associated with the dissemination of this carbapenemase worldwide. In NDM-1 and OXA-370 producing strains, the most observed clonal groups were NDM_A/ST37 (41.6%) and OXA-370_A/ST16 (95.4%) respectively. Phylogenetic analysis from the genome supported the groups made by MLST. Particularly in KPC-2 producing K. pneumoniae belonging to CC11 and in OXA-370 producing K. pneumoniae of ST16 we observed the accumulation of mutations in genes associated with resistance and porins. We believe these mutations may contribute to the resistance phenotype and thus assist in the success of prevalent clones. This study showed the presence of carbapenemases producing multiresistant samples in our country carrying a large arsenal of acquired resistance genes associated with mobile genetic elements, but also presenting mutations associated with resistance and some virulence genes, which is worrisome due to the limited therapeutic options
keywords: OXA-370
NDM-1
Carbapenemases Tipo KPC-2
DeCS: Klebsiella pneumoniae
Genes MDR
Oxacilina
Reação em Cadeia da Polimerase
Issue Date: 2016
Citation: PEREIRA, P. S. Caracterização molecular de Klebsiella pneumoniae produtoras de carbapenemases do tipo KPC-2, NDM-1 e OXA-370 isoladas no Brasil. 2016. 213f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2016
Date of defense: 2016-04-18
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Teses de Doutorado

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