Aplicação de Técnicas Moleculares para Avaliação da Carga Parasitária de Amostras de Insetos Triatomíneos Infectados por Trypanosoma cruzi

Abstract

A doença de Chagas constitui a quarta mais importante doença tropical, suplantada somente pela malária, tuberculose e esquistossomose. A análise por microscopia é o método clássico para descrição de infecção natural de triatomíneos por Trypanosoma cruzi e apresenta algumas limitações como baixa sensibilidade e reprodutibilidade, dificuldade de exame nos diferentes estágios evolutivos dos vetores, necessidade da análise em insetos frescos, além de ser um procedimento extremamente laborioso. Nesse contexto, a utilização da PCR em Tempo real (qPCR) para o diagnóstico de T. cruzi apresenta várias vantagens, como maior sensibilidade, rapidez e reprodutibilidade, possibilitando investigar o desenvolvimento do parasito no vetor. Neste trabalho, foi desenvolvido um ensaio multiplex de qPCR pelo sistema TaqMan com alvos para o gene correspondente à região 12S do RNA ribossomal de triatomíneos e para o DNA nuclear satélite de T. cruzi, capaz de estimar a carga parasitária em amostras de insetos positivas para infecção por T. cruzi. Além disso, padronizamos uma qPCR com transcrição reversa (RT-qPCR), com alvo para o gene T. cruzi GAPDH, capaz de quantificar parasitos viáveis em amostras de triatomíneos. A reação de qPCR multiplex apresentou uma detecção linear para T. cruzi na faixa de 105 a 0,5 equivalentes de parasitos e para triatomíneo na faixa de 3 a 1,5 x 10-4 equivalentes de triatomíneo. Além disso, foi possível determinar um Limite de Detecção em 0,41 eq. Parasitos. Para validação clínica da PCR quantitativa, 13 amostras de triatomíneos coletados em campo, positivas para infecção por T. cruzi, foram quantificadas e apresentaram cargas variadas, cuja mediana foi de 105 eq. parasito/eq. triatomíneo Posteriormente, para acompanhar o desenvolvimento do T. cruzi (Dm28c) em Rhodnius prolixus, ao longo de todo o trato digestivo e das suas diferentes porções, RNA e DNA total foram extraídos de insetos em diferentes períodos após a alimentação com sangue contendo T. cruzi. Foi possível observar que, a partir de 9 dias pós-alimentação dos insetos, ocorre uma diminuição da quantidade de parasitas viáveis (detectados por RNAm) em todo o trato digestivo do vetor, que não é acompanhada pela diminuição da quantidade de parasitos totais (detectados por DNA). Sendo que, avaliando separadamente o conteúdo intestinal, esta diminuição ocorre principalmente na porção anterior do intestino médio do inseto. Em paralelo, foi observado através de uma RT-qPCR com alvo no gene TcS5, altamente expresso nas formas tripomastigotas, detecção destas formas apenas na quarta semana após alimentação. Os ensaios de qPCR e RT-qPCR desenvolvidos neste estudo contribuirão para para determinar a taxa de infecção de triatomíneos silvestres, além de auxiliar em estudos sobre competência vetorial de triatomíneos e a incidência da doença de Chagas