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Title: Efeito do dietilditiocarbamato de sódio isolado e em combinação com benzonidazol sobre Trypanosoma cruzi: nova estratégia para otimização da quimioterapia antiparasitária
Advisor: Santos, Marcos André Vannier dos
Members of the board: Soeiro, Maria de Nazaré Correia
El-Bachá, Ramon dos Santos
Soares, Milena Botelho Pereira
Authors: Menezes, Diego Silva
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.
Abstract: INTRODUÇÃO: Estima-se que a doença de Chagas afete aproximadamente 8 milhões de pessoas, levando a óbito cerca de 12.000 indivíduos por ano, principalmente, nas Américas do Sul e Central. Apesar da grande demanda, no Brasil apenas o benzonidazol está disponível para o tratamento da doença de Chagas, o qual apresenta eficácia limitada e consideráveis efeitos colaterais. Além disso, há registro de cepas do Trypanosoma cruzi que apresentam resistência natural ou selecionada pelo uso prolongado desse fármaco. Assim, torna-se de fundamental importância o desenvolvimento de fármacos mais efetivos ou combinações que apresentem efeitos sinergísticos. Uma abordagem promissora está baseada no uso de substâncias que inibam as enzimas reguladoras do metabolismo redox parasitário, como a tripanotiona redutase e a superóxido dismutase ferro (SOD-Fe), por serem encontradas seletivamente nos tripanossomatídeos. A atividade da SOD tem um papel relevante em parasitoses, atuando como um potente antioxidante que protege os parasitos do ataque da resposta imune do hospedeiro, a qual envolve a produção de espécies químicas oxidantes e modula a ação de diversos antiparasitários. OBJETIVO: Desta forma, neste trabalho objetivamos avaliar o papel do antagonista da atividade superóxido dismutase, o dietilditiocarbamato de sódio (DETC) e do seu precursor o dissulfiram (DF), em presença ou ausência do benzonidazol (Bz). MATERIAL E MÉTODOS: Para avaliação da ação tripanocida deste inibidor, isolado ou combinado, experimentos foram conduzidos com as três formas evolutivas do T. cruzi das cepas Y e Colombiana. Nos ensaios para avaliação da inibição parasitária in vitro, determinação da IC50 e da FIC da combinação, foram avaliadas concentrações na faixa de 0.6-10 μM, por 24 e 120 horas, em meio LIT completo. Para os experimentos de citotoxicidade, foram usados macrófagos murinos residentes e as concentrações do DETC e DF variaram de 1-200 μM. Posteriormente, foram avaliados os aspectos ultraestruturais, atividades enzimáticas, geração de espécies oxidantes, respiração parasitária e participação de grupamentos sulfidrilas conduzidos na ausência e presença de diferentes concentrações das substâncias isoladas ou em combinação. Ensaios in vivo, usando o modelo murino (linhagem suíça) foram realizados para avaliação da eficácia sobre as fases aguda e crônica da doença de Chagas. Nesses ensaios, avaliou-se a parasitemia, sobrevida, dosagem de enzimas marcadoras de toxicidade, análise histopatológica e desempenho locomotor. RESULTADOS: Os resultados demonstraram um efeito com inibição dependente da concentração sob a proliferação in vitro, em todas as formas evolutivas avaliadas, sendo a IC50 do Benz reduzida em 43,86% quando combinado ao DETC. Dentre as organelas observadas as mais afetadas foram as mitocôndrias e o retículo endoplasmático, as quais apresentavam dilatações acentuadas. As mitocôndrias dos parasitos apresentaram depósitos eletrondensos e redução significativa na sua função. As drogas combinadas ocasionaram diminuição da atividade da SOD-Fe e da expressão de grupamentos sulfidrilas e, consequentemente, a acentuada produção de espécies oxidantes e o aumento da peroxidação lipídica. Os resultados in vivo demostraram que o DETC em combinação com Benz foi capaz de inibir, significativamente, a parasitemia, aumentar seis vezes a sobrevida e diminuir as lesões cardíacas dos animais infectados com a cepa Y, no modelo de fase aguda. Todavia, quando estudamos a ação do DF combinado ao Bz no modelo de fase crônica e com a cepa naturalmente resistente ao Bz, a cepa Colombiana, foi possível observar uma melhora dos parâmetros bioquímicos e histológicos, mas houve menor sobrevida quando comparado ao grupo controle, porém sem diferença em relação ao desempenho locomotor. CONCLUSÕES: Assim, o presente trabalho demonstra uma nova abordagem para modulação das vias redox do T. cruzi, sendo, entretanto, requeridos novos estudos que incluam diferentes doses, vias de administração e tempos de tratamento para o desenvolvimento de uma melhor estratégia terapêutica para doença de Chagas.
Abstract: INTRODUCTION: It is estimated that Chagas disease affects around 8 million people, causing about 12.000 deaths every year in South and Central America. Despite the great demand, only benznidazole is available for treatment in Brazil, which shows limited effectiveness and substantial side effects. In addition, there are Tryanosoma cruzi strains, which display natural or drug-selected resistance risen by prolonged use. Thus, it is important to develop strategies based in more effective drugs, which can be used alone, or in synergistic associations. A promising approach is based on the use of molecules to specifically inhibit enzymes, which play key roles in redox metabolism, such as trypanothione reductase and iron superoxide dismutase (Fe-SOD), which are Trypanosomatid- specific proteins. The Fe-SOD activity is important to immune response evasion once it detoxifies reactive oxygen species produced by host cells against parasites as well as modulate several antiparasitic agents. OBJECTIVES: The aim of this work was to evaluate the effect of the Fe-SOD antagonist sodium diethyldithiocarbamate (DETC) and its precursor dissulfiram (DF) associated or not to benzonidazol (Benz) against T. cruzi. METHODS: These drugs were tested in all three developmental stages of T. cruzi (Colombian and Y strains), in order to evaluate their trypanocide effects. Parasites were cultured in the presence of drugs alone or combined at concentrations ranging between 0.6 and 10.0 mM for 24 h or 120 h in complete LIT medium. Mammal cell cytotoxicity assays were performed in vitro using murine macrophages and drugs concentration ranging from 1 to 200 μM. Furthermore, we evaluated ultrastructural aspects, enzymatic activities, generation of oxygen reactive species, parasite respiration and sulfhydryl group quantification before and after incubation with different concentrations of isolate and combined drugs. In vitro infection assays as well as murine models of chronic and acute Chagas disease were used to test in vivo drug efficacy. In vivo evaluations included parasitemia, survival, enzyme quatification, histopatologic analysis and locomotor performance. RESULTS: The results showed a dose-dependent effect of drugs over parasite growth inhibition in vitro in all stages evaluated and the Benz IC50 was reduced in 43.86% when associated to DETC. The parasite mitochondria and endoplasmic reticulum were markedly swollen. The mitochondria showed also electron dense deposits and significantly reduced functioning. The combined drugs inhibited SOD-Fe activity and decreased sulfhydryl group expression and so enhanced production of reactive oxygen species leading to increased lipid peroxidation. In vivo results indicate that DETC and BENZ association was able to inhibit parasitemia, to increase six-fold the survival of T. cruzi-infected mice and to decrease cardiac damage of animals infected with Y strain in acute model of Chagas disease. In combined use of DF and Benz of chronic model of Chagas disease using Colombiana, it was possible to observe improvement of biochemical and histological parameters, but no differences were observed on survival and locomotor performance as compared to controls. CONCLUSION: Thus, the present work shows a new approach to modulate the redox metabolism of T. cruzi and further studies about doses, administration routes and treatment time will improve a possibility to a new therapeutic strategy to fight Chagas disease.
Keywords: Trypanosoma cruzi
Chemotherapy
Redox Metabolism
Superoxide dismutase (SOD)
Oxidative stress
Chagas' disease
Free radicals
keywords: Trypanosoma cruzi
Quimioterapia
Metabolismo redox
Superoxido dismutase (SOD)
Estresse oxidativo
Doença de Chagas
Radicais livres
DeCS: Trypanosoma cruzi
Quimioterapia
Superoxido dismutase
Estresse oxidativo
Doença de Chagas
Radicais livres
Issue Date: 2013
Publisher: Instituto Gonçalo Moniz
Citation: MENEZES, D. S. Efeito do dietilditiocarbamato de sódio isolado e em combinação com benzonidazol sobre Trypanosoma cruzi: nova estratégia para otimização da quimioterapia antiparasitária. 2013. 118 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa) – Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Gonçalo Moniz, Salvador, 2013.
Date of defense: 2013-12-16
Place of defense: Salvador/Ba
Department: Coordenação de Ensino
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz
Program: Pós-Graduação em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa
Copyright: restricted access
Appears in Collections:BA - IGM - Teses de Doutorado

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