Análise de dados de sequenciamento de RNA voltados à comparação de expressão gênica visando a um melhor entendimento dos mecanismos de resistência aos antimoniais

Abstract

A origem do que hoje chamamos de Sequenciamento de Nova Geração foi impulsionada pelo sequenciamento do genoma humano e pela necessidade de inovações técnicas, tecnológicas e computacionais que reduzissem os custos e o tempo de análise. Essa necessidade possibilitou de uma maneira sem precedentes o aumento dos estudos de genômica e transcriptômica. O melhor entendimento do transcriptoma de um organismo é essencial para identificar e interpretar como a maquinaria gênica atua nos processos biológicos. Um grupo de organismos de grande interesse em saúde pública e causadores do conjunto de doenças negligenciadas conhecidas como leishmanioses são os parasitos protozoários do gênero Leishmania . Anualmente, estima-se que aproximadamente 300 mil novos casos e 20 mil mortes relacionadas à leishmaniose vi sceral são registrados. O tratamento das leishmanioses é problemático devido principalmente à alta toxicidade dos antimoniais pentavalentes e o surgimento de parasitos resistentes a esses compostos. Por fim, considerando que esses parasitas são agentes etiológicos de uma importante doença negligenciada, pesquisas que tragam novas perspectivas para o entendimento dos mecanismos de resistência aos compostos antimoniais são de particular importância. Neste contexto, analisamos comparativamente o transcriptoma de duas linhagens de Leishmania infantum (MHOM/BR/74/PP75), uma selvagem (LiWTS) e outra resistente ao antimônio trivalente (SbIII) (LiSbR) com o objetivo de identificar genes diferencialmente expressos que possam estar associados aos mecanismos de resistência. Para tanto, utilizamos a plataforma de sequenciamento Illumina HiSeq 2000 para o sequenciamento das amostras. Parte do processo analítico env olveu a reanotação funcional dos genes de L. infantum JPCM5 que foi utilizada como cepa referência para o processo de mapeamento das leituras geradas. As amostras foram avaliadas quanto à sua qualidade com os programas Prinseq e FastQC. As sequências adaptadoras e de baixa qualidade foram removidas utilizando o Trim momatic. O TopHat2 foi utilizado para o processo de mapeamento das leituras no genoma de L. infantum JPCM5 e o DESeq2 para a realização das anális es estatísticas. Esse pipeline analítico e a busca por genes que possuíssem um p-valor ajustado < 0.05 e um fold-change > 1.2 possibilitaram a identificação de 719 genes diferencialment e expressos (699 com regulação positiva e 20 com regulação negativa) quando comparamos a linhagem resistente tratada 0.06 mg de SbIII (LiSbR 0.06) com a linhagem LiWTS , e 779 genes diferencialmente expressos (749 com regulação positiva e 30 com regulação negativa) quando comparamos as linhagens LiSbR 0.06 e LiWTS 0.06, ambas tratadas com baixa dose de antimônio. No entanto, não observamos nenhum gene diferencialmente expresso quando comparamos as linhagens selv agens tratadas e não tratadas com Sb III , indicando ausência de transcrição gênica difer encial devido ao estresse da droga. Além disso, realizamos a classificação funcional dos produtos proteicos destes genes de acordo com o Pfam . Observamos que grande parte desses genes codificam chaperonas e proteínas relacionadas a estresse, transportadores, prot eínas estruturais, proteínas envolvidas nos processos de ubiqu itinação e processamento de DNA e RNA, enzimas metabólicas (envolvi das nos processos de proteólise, metabolismo de ácidos graxos, carboidratos e proteínas, entre outras), controle do ciclo celular, proteínas que atuam na mediação da interação com outras proteínas, proteínas com função desconhecida na biologia de Leishmania spp. e proteínas hipotéticas. Neste estudo observamos um conjunto de genes diferencialmente expressos em L. infantum evidenciando que o fenômeno de resistência desse parasito aos compostos antimoniais é multigênico e complexo.