Análise proteômica da forma tripomastigota de uma população de Trypanosoma cruzi susceptível e outra resistente ao benzonidazol

Abstract

A Doença de Chagas é um grande problema de saúde pública na América Latina. Atualmente nos países das Américas Central e do Sul há de 16 a 20 milhões de pessoas infectadas pelo Trypanosoma cruzi e 40 milhões sob risco da infecção. O tratamento da Doença de Chagas com os nitroderiva dos, benzonidazol e nifurtimox, apresenta consideráveis efeitos colaterais, além de baixa eficácia na fase crônica da doença e variações na eficácia em pacientes de diferentes origens geográficas. Este fato pode ser explicado pela resistência natural do T. cruzi aos nitroderivados. A resistência a drogas tem um grand e impacto na quimioterapia da Doença de Chagas, aumentando a falha terapêutica e limitando as opções de tratamento. Através de estudos dos mecanismos de resistência do T. cruzi a drogas, novos alvos bioquímicos poderão ser identificados. O objetivo deste trabalho é identificar proteínas nas formas tripomastigotas do T. cruzi que possam estar envolvidas no mecanismo de resistência ao benzonidazol. Devido às diferenças entre as formas morfoevolutivas do parasito, é importante que o mecanismo de resistência seja estudado nas diferentes fases do s eu ciclo de vida. Além disso, a análise proteômica é particularmente importante por que a regulação da expressão gênica nestes organismos ocorre por mecanismos de c ontrole pós-transcricionais. As formas tripomastigotas foram obtidas através de infecção in vitro de células Vero com duas populações de T. cruzi : BZR, selecionada in vivo com resistência ao benzonidazol, e seu par susceptível,BZS (Murta & Ro manha, 1998). Para garantir a qualidade das amostras de tripomastigotas, a contam inação da cultura de células e parasitos por Mycoplasma foi monitorada através da PCR gênero-específica e da observação de células ao microscópio óptico de fluo rescência. A diferença de susceptibilidade determinada in vitro ao Bz entre as populações BZR e BZS de T. cruzi foi de aproximadamente 8 vezes quando avaliamos a atividade direta da droga sobre as formas tripomastigotas, e de 2 a 3 vezes s obre a liberação dos parasitos de células infectadas. Formas tripomastigotas das duas populações foram produzidas, purificadas e concentradas em quantidade suficiente para a análise por eletroforese bidimensional. Proteína total das duas populações f oi analisada por eletroforese bidimensional e as imagens dos 6 géis bidimensionai s de 17cm (triplicatas de cada população) foram analisadas pelo software PDQuest. As proteínas diferencialmente expressas entre as duas populações foram indicadas a partir de análise quantitativa da intensidade dos spots detectados e pareados entre os géis bidimensionais de cada população. 244 spots foram analisados e 23 spots apresentaram intensidade diferencial entre as populações, sendo: 3 expressos somente na população BZR e 5 somente na população BZS, 5 mais expressos na população BZR e 10 mais expressos na população BZS. Estes spots serão localizados nos géis, excisados e digeridos por Tripsina para identificação por espectrometria de massa.