O gene da enzima ferro-superóxido dismutase-A (TcFeSOD-A) está amplificado numa população de Trypanosoma cruzi com resistência induzida in vitro ao benzonidazol

Abstract

A enzima Superóxido Dismutase (SOD) remove o excesso do ânion superóxido via dismutação para oxigênio e peróxido de hidrogênio, sendo o componente central da defesa antioxidante dos organismos. Em T. cruzi foi descrita a presença de duas isoformas dessa enzima, TcFeSOD-A e TcFeSOD-B (Ismail et al., 1997). Murta et al. (2002) utilizando a metodologia de Representação da Expressão Diferencial (RDE) selecionaram o gene TcFeSOD-A, que foi superexpresso na população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao benzonidazol (B Z) 17LER, comparado com seu par sensível 17WTS. No presente trabalho, o gene TcFeSOD-A, foi caracterizado em 25 populações e clones do T. cruzi sensíveis, naturalmente resistentes ou com resistência induzida in vitro, ou selecionada in vivo ao BZ. Análise de Northern blot com a sonda do gene TcFeSOD-A, mostrou a presença de dois transcritos um de 1,2 Kb e outro de 1,6 Kb para todas as amostras de T. cruzi analisadas. A população 17LER apresentou nível de mRNA três vezes maior em comparação com seu par sensível (17WTS). A mesma diferença no nível de mRNA foi observada por RT-PCR quantitativo em tempo real. As outras populações do T. cruzi apresentaram os mesmos níveis de mRNA, independente do fenótipo de resistência a drogas. O número de cópias estimado por Southern blot mostrou que o gene TcFeSOD-A está duas vezes mais amplificado na população 17LER comparado com a 17WTS. O gene TcFeSOD-A está localizado em um ou dois cromossomas, dependendo da cepa do parasita e não está associado com a resistência a drogas. O gene da TcFeSOD-A está presente em duas bandas cromossômicas que foram duas vezes mais intensas na população 17LER do que na 17WTS, confirmando os resultados de Southern blot. Análises de Western blot, mostraram que o anticorpo policlonal anti-TcFeSOD-A recombinante reconheceu um polipeptídeo de 23 kDa em todas as amostras de T. cruzi analisadas. A intensidade desse polipeptídeo foi similar em todas as amostras, exceto na população 17LER, que apresentou duas vezes mais expressão comparado com a 17WTS. Em concordância com esses dados, a atividade enzimática da TcFeSOD foi também duas vezes maior na população 17LER do que na 17WTS. As demais amostras apresentaram a mesma atividade enzimática, independente do fenótipo de resistência a drogas. Análises das sequências de nucleotídeos e de aminoácidos do gene TcFeSOD-A das cepas de T. cruzi mostraram um polimorfismo relacionado com o zimodema da cepa e não com o fenótipo de resistência a drogas. Nossos resultados mostram uma associação da amplificação do gene TcFeSOD-A com a resistência in vitro do T. cruzi ao BZ.