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ThesisCopyright
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2018-03-25
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INFLUÊNCIA DOS INFLAMASSOMOS AIM2, NLRP3 E DA CARGA PARASITÁRIA NA PATOGÊNESE DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA POR LEISHMANIA (VIANNIA) BRAZILIENSIS: ESTUDO DE PREDITORES DE PROGNÓSTICO
Leishmaniose Cutânea
Leishmania braziliensis
Inflamassomos
Carga Parasitária
Prognóstico
Leishmaniose Cutânea
Leishmania braziliensis
Inflamassomos
Carga Parasitária
Prognóstico
Moreira, Regina Barbosa | Date Issued:
2017
Author
Advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada por grande variedade de espécies do gênero Leishmania. A LTA apresenta intenso polimorfismo clínico, que pode variar desde quadro assintomático, até lesões desfigurantes. No Brasil L. (V.) braziliensis é a espécie dermotrópica mais amplamente distribuída. Até recentemente a abordagem dos fatores imunes relacionados à LTA era quase que restrita ao estudo da imunidade adquirida. Entretanto, a relação entre parasita e hospedeiro começa a ser definida já na fase inicial da infecção, regida pela imunidade inata. Esta resposta é mediada nos fagócitos profissionais que interagem, entre outros, com um conjunto de receptores não clonais, denominados de receptores de reconhecimento de padrões (PRR), destinados a reagir aos padrões moleculares relacionados aos patógenos (PAMP), ou padrões moleculares relacionados ao perigo (DAMP). Os inflamassomos canônicos são um conjunto de receptores citosólicos, que ao serem ativados por PAMP ou DAMP, iniciam um processo de montagem de plataforma proteica responsável pela ativação autocatalítica da pró-caspase-1, que irá ativar a IL-1\03B2 e IL-18. O objetivo deste trabalho foi avaliar fatores preditores de evolução de doença através da análise dos inflamassomos canônicos AIM2 e NLRP3 e IL-1\03B2 tanto in vitro como in vivo e a carga parasitária in vivo. Os estudos in vivo abordaram culturas de queratinócitos humanos HaCat e células de linhagem monocítica humana THP1 transformadas em macrófagos, cocultivadas com a cepa infectiva código internacional MHOM/BR/2000/LTCP-13396 de L. (V.) braziliensis. Nestes ensaios não foi possível relacionar as coculturas com a expressão gênica do NLRP3, AIM2 ou IL-1\03B2. Avaliamos ainda, lesões ativas de pacientes com LTA no Rio de Janeiro, área endêmica de L. (V.) braziliensis e relacionamos com apresentação clínica e resposta à terapia com Glucantime®. Na PCR em tempo real, a expressão gênica do AIM2 foi mais baixa na leishmaniose cutânea localizada, comparada com a forma mucosa. Houve uma redução da expressão do AIM2 nos pacientes com a leishmaniose cutânea localizada com boa resposta ao tratamento quando comparados com a pele normal, indicando que nesta forma deve haver um mecanismo de inibição da expressão do AIM2. Na análise pela imunohistoquímica observamos significativo aumento percentual de células AIM2+ em pacientes com má resposta ao tratamento, quando comparados aos pacientes que responderam bem ao tratamento. Encontramos ainda, um predomínio de células AIM2+, comparadas com células NLRP3+, demonstrando que o AIM2 foi mais abundante do que o NLRP3. Embora a expressão gênica do NLRP3 tenha sido detectada em cerca de 77% dos casos, foi possível visualizar células NLRP3+ em apenas 25% das amostras. Na literatura, a produção e a atividade do GP63, fator de virulência expresso nas espécies de Leishmania, vem sendo associada à uma redução da secreção da IL-1\03B2, possivelmente em decorrência da clivagem do NLRP3. Logo, o GP63 pode estar relacionado à escassez de células NLRP3+. Os nossos dados demonstram que o AIM2 é um inflamassomo importante na LTA e está diretamente associado à gravidade das lesões. Avaliamos também a carga parasitária pela PCR em tempo real com a quantificação absoluta utilizando a subunidade menor de Leishmania do gene RNA (SSR). Não encontramos uma relação entre a carga parasitária e os achados clínicos, mas os nossos dados confirmam a afirmação anterior de que infecções crônicas por L. (V.) braziliensis se associam com parasitismo escasso.
Abstract
American tegumentary leishmaniasis (ATL) is caused by a great variety of Leishmania species and presents a great clinical pleomorphism. It varies in severity, from asymptomatic, to disfiguring and even fatal forms. In Brazil, L. (V.) braziliensis is the most widely distributed dermotropic species. Mostly works about immune response evaluation have been including factors restricted to acquired immune response. Still, the host-parasite relationship begins in the early phase of the infection, that is orchestrated by innate immune system. This response is mediated mostly by phagocytes and, among others, by a set of non-clonal receptors on cytosol, named pattern recognition receptors (PRR), that interact to pathogens-associated molecular patterns (PAMPs), or danger-associated molecular patterns (DAMPs). These events assemble a cytosolic proteic platform, named canonical inflammasome, that recruit and activates caspase-1. This enzyme activates IL-1\03B2 and IL-18. The objective of this work was to evaluate predictive factors of disease through the analysis of canonical inflammasomes AIM2 and NLRP3 and IL-1\03B2 both in vitro and in vivo and the parasite load in vivo. The in vitro assay evaluated the inflammasomes AIM2, NLRP3 and IL-1\03B2 in human keratinocytes HaCaT and in human lineage monocyte THP1 cell, co-cultivated with infective L. (V.) braziliensis, international code MHOM/BR/2000/LTCP-13396. It was not possible to relate these co-cultures with the gene expression of NLRP3, AIM2 or IL-1\03B2. We also evaluated the gene expression by real-time PCR, and the protein abundance by immunohistochemistry of the AIM2 and NLRP3 inflammasomes in active lesions from patients in Rio de Janeiro state, an endemic area of ATL caused by L. (V.) braziliensis. Additionally, it was compared these findings with clinical presentation and response to therapy with Glucantime®
The real-time PCR showed lower AIM2 in cutaneous leishmaniasis, compared to mucosal leishmaniasis. Furthermore, the AIM2 gene expression was downregulated on good responders, compared to normal skin samples. This last result indicates that, in good responders, there is a mechanism, not described yet, of inhibition of expression of this receptor. By immunohistochemistry, there was a higher percentage of AIM2+ cells in poor responders, compared with good responders. It was also found, a predominance AIM2+ cells, compared to the NLRP3+ cells. Therefore, in this series the AIM2 is more abundant than the NLRP3 on ATL. The gene expression of NLRP3 was present in about 77% of samples tested, but cells NLRP3+ were visualized in only 25% of the fragments by immunohistochemistry. From literature review, the activity of the metalloprotease GP63, a virulence factor expressed by Leishmania species, was associated with a reduction of IL-1\03B2 secretion, possibly due to a cleavage of the NLRP3 inflammasome. Thus, the GP63, may be related with scarcity of NLRP3+ cells on clinical samples. Our data indicate that the NLRP3 was not related to the clinical forms or with groups of response to therapy. Taken together, our data demonstrated that AIM2 is an important inflammasome in ATL and is directly associated with severity of lesions. It was also evaluated the parasite load by absolute quantification real-time PCR. Leishmania small subunit RNA gene (SSR) was used to access parasite load. It was not found a relation of parasite load and clinical outcomes, but our data provided contribution to previous statement that chronic L. (V.) braziliensis infections corresponded to scarce parasitism.
Keywords in Portuguese
Imunidade InataLeishmaniose Cutânea
Leishmania braziliensis
Inflamassomos
Carga Parasitária
Prognóstico
DeCS
Imunidade InataLeishmaniose Cutânea
Leishmania braziliensis
Inflamassomos
Carga Parasitária
Prognóstico
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