Please use this identifier to cite or link to this item: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/23172
Title: Diagnóstico laboratorial da infecção pelo Parvovírus Humano B19 em pacientes com falência hepática aguda
Advisor: Pinto, Marcelo Alves
Authors: Alves, Arthur Daniel Rocha
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: A infecção pelo Parvovírus humano B19 (B19V) geralmente é aguda e autolimitada, podendo causar uma ampla variedade de manifestações clínicas. Estudos relatam a ocorrência de hepatite em pacientes imunocompetentes infectados pelo B19V, com manifestações hepáticas que variam desde alterações bioquímicas do fígado até a falência hepática aguda (FHA). O objetivo desse estudo foi otimizar a PCR em tempo real (qPCR) para a detecção e quantificação de DNA-B19V em amostras clínicas e dessa forma determinar a importância deste vírus como um dos agentes de hepatite aguda e fulminante. Para otimizar a qPCR, inicialmente foram testadas um painel de amostras positivas (n= 20) e negativas (n= 36) para o B19V, composto por soros de pacientes infectados pelo HIV, Rubéola, Dengue, Herpesvírus humano 1, Vírus da Hepatite A, Vírus da Hepatite B e um controle positivo para Parvovírus canino a fim de avaliar a especificidade da técnica. Após a extração do DNA viral foi realizada a qPCR através das metodologias Sybr Green® e TaqMan®, utilizando oligonucleotídeos para a região NS1 do B19V e uma curva padrão sintética para quantificação absoluta da carga viral. Após a otimização do teste, amostras de soro e tecido hepático de pacientes com FHA (n=30) foram testados. A metodologia de Sybr Green® apresentou coeficiente de linearidade (R2)=0,99, eficiência de 97% e um limite de detecção de 4,32x10¹cópias/\03BCL. A metodologia de TaqMan® apresentou R2=0,99, eficiência de 95% e um limite de detecção de 1,83 cópias/\03BCL. Na metodologia de Sybr Green® um resultado falso positivo foi observado enquanto que na metodologia de TaqMan® nenhum resultado falso positivo ou falso negativo foi detectado. Desta forma, a metodologia de TaqMan® foi utilizada para avaliar as amostras de pacientes com FHA (n= 30). Entre elas, sete amostras pareadas de soro e tecido hepático foram positivos para B19V-DNA, com cargas virais variando de 1,07 a 8,52 cópias/\03BCL no soro e de 2,5x101 a 1,6x102cópias/\03BCL no tecido hepático. Entre esses pacientes, três tinham hepatite sem origem conhecida (hepatite criptogênica), três hepatite viral (dois por HBV e um por CMV) e um caso hepatite medicamentosa por izoniazida. Entre os pacientes com FHA e B19V, quatro evoluíram ao óbito, dois dos quais estavam coinfectados por HBV e dois com hepatite criptogênica. Esses resultados indicam que o B19V deve ser considerado no diagnóstico diferencial de hepatites criptogênicas e na FHA e demonstram a importância em otimizar um método molecular sensível e específico para diagnosticar esses casos de infecção.
Abstract: Human Parvovirus B19 (B19V) infection is usually acute and self-limited and may cause a wide variety of clinical manifestations. Studies report the occurrence of hepatitis in immunocompetent patients infected with B19V, with hepatic manifestations ranging from biochemical changes of the liver to acute liver failure (ALF). The objective of this study was to optimize real-time PCR (qPCR) for detection and quantification of B19V-DNA on clinical samples and thus to evaluate the role of B19V as an agent of acute and fulminant hepatitis. To establish the qPCR, a panel of standard samples positive (n= 20) and negative (n= 36) for B19V, consisting of sera from patients infected with HIV, Rubella, Dengue, HSV, HAV, HBV and a positive control of canine parvovirus to assess the specificity of the technique. After extracting the viral DNA, qPCR was performed through the Sybr Green® and TaqMan® methodologies, using primers and probes for the NS1 region of B19V and a synthetic standard curve for absolute quantification of viral load. After optimization of the test, serum and hepatic tissue samples from patients with ALF (n= 30) were tested. The Sybr Green® methodology showed R2= 0.99, 97% of efficiency and a detection limit of 4.32x10¹copies/\03BCL. The TaqMan® methodology showed R2= 0.99, 95% of efficiency and a detection limit of 1.83copies/\03BCL. In the Sybr Green® methodology a false positive result was found whereas in the TaqMan® methodology no false positive or false negative results were observed. Thus, the TaqMan® methodology was used to test the samples of patients with ALF (n= 30). Among them, seven paired serum and hepatic tissue samples were positive for B19V-DNA, with viral loads ranging from 1.07 to 8.52 copies/\03BCL in serum and 2.5x101 to 1.6x102 copies/\03BCL in hepatic tissue. Of these seven patients, three had cryptogenic hepatitis, three viral hepatitis (two for HBV and one for CMV), and one hepatitis of izoniazid. In addition, four cases evolved to death, two co-infected with HBV and two with cryptogenic hepatitis. These results indicate that B19V should be considered in the differential diagnosis of cryptogenic hepatitis and ALF and demonstrate the importance of establishing a sensitive and specific molecular method to diagnose these cases of infection.
keywords: Parvovirus B19 Humano
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Falência Hepática Aguda
Diagnóstico
DeCS: Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Parvovirus B19 Humano
Falência Hepática Aguda
Issue Date: 2017
Citation: ALVES, Arthur Daniel Rocha. Diagnóstico laboratorial da infecção pelo Parvovírus Humano B19 em pacientes com falência hepática aguda. 2017. 128f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, 2017.
Date of defense: 2017
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBP - Dissertações de Mestrado

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
arthur_alves_ioc_mest_2017.pdf8.9 MBAdobe PDFView/Open


FacebookTwitterDeliciousLinkedInGoogle BookmarksBibTex Format mendeley Endnote DiggMySpace

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.