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Title: Avaliação da Nested PCR em único tubo colorimétrica em diferentes amostras biológicas de pacientes com tuberculose
Other Titles: Evaluation of colorimetric single tube Nested PCR in different biological samples of patients with tuberculosis
Advisor: Schindler, Haiana Charifker
Members of the board: Schindler, Haiana Charifker
Montenegro, Sílvia Maria Lucena
Lima, Andrea Santos
Authors: Salazar, Marcela Pereira
Coadvisor: Monteiro, Juliana Figueirêdo da Costa Lima Suassuna
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Abstract: A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa com altas taxas de morbimortalidade no mundo. Seu diagnóstico é difícil e possui limitações, sobretudo nas formas paucibacilares. A reação em cadeia da polimerase (PCR) vem sendo utilizada como auxiliar no diagnóstico da TB, por ser mais rápida, ter alta sensibilidade e especificidade. A Nested PCR em único tubo (STNPCR) é mais sensível, tem menor risco de contaminação cruzada e permite a identificação do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) diretamente de amostras clínicas. A STNPCR colorimétrica é um sistema molecular rápido, de fácil execução e interpretação. O objetivo deste trabalho foi definir os parâmetros da STNPCR colorimétrica automatizada em diferentes amostras biológicas de pacientes com TB. Foram analisadas 98 amostras de plasma, 100 de células mononucleares do sangue periférico (do inglês, peripheral blood mononuclear cells - PBMC), 95 de urina, 20 de escarro e 5 de líquido pleural. O DNA foi extraído e submetido à STNPCR, que teve como alvo a sequência de inserção IS6110. Foram usados dois pares de primers: TJ3 e TJ5; OLI 5 e STAN 3. O OLI 5 teve adicionado à sua porção 5’ uma biotina. Para a reação colorimétrica, utilizou-se uma sonda específica. Os resultados mostraram um limite de detecção do DNA de 1pg/μL em água Milli-Q®, 1fg/μL em urina, 10pg/μL em sangue (no plasma e PBMC), 1fg/μL em líquido pleural e 1fg/μL em escarro. O valor do cut off foi 0,092 em urina, 0,110 em plasma, 0,090 em PBMC, 0,081 em líquido pleural e 0,164 em escarro. A sensibilidade variou de 55,5% em plasma a 75,0% em líquido pleural. A especificidade variou de 51,5% em urina a 100% em líquido pleural. O índice Kappa entre a detecção colorimétrica e o gel de agarose foi substancial no escarro. Embora a sensibilidade e especificidade tenham tido grande variação, a técnica pode ser eficaz para auxiliar o diagnóstico da TB. Para a validação dos resultados, é necessário analisar um maior número de amostras biológicas.
Abstract: Tuberculosis (TB) is an infectious disease with high morbidity and mortality rates in the world. Its conventional diagnosis is difficult and has limitations, especially in paucibacillary forms. Polymerase chain reaction (PCR) has been used as an aid in the diagnosis of TB, because it is faster, has high sensitivity and specificity. Single Tube Nested PCR (STNPCR) has been shown to be more sensitive, offers a lower risk of cross-contamination and allows the identification of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) directly from clinical samples. Colorimetric STNPCR is a fast molecular system, easy to perform and interpret. The objective of this work was to define the parameters of automated colorimetric STNPCR from biological samples of TB patients. 98 samples of plasma, 100 samples of peripheral blood mononuclear cells - PBMC, 95 samples of urine, 20 samples of sputum and 5 samples of pleural fluid were analyzed. The DNA was extracted and submitted to STNPCR, which targeted the insertion sequence IS6110. Two pairs of primers were used: TJ3 and TJ5; OLI 5 and STAN 3. OLI 5 had added in its 5 'portion a biotin. For the colorimetric reaction, a specific probe was used. The results showed a DNA detection limit of 1pg/μl in Milli-Q® water, 1 μg/μl in urine, 10 μg/μl in blood (both in plasma and PBMC), 1 μg/μl in pleural fluid and 1 μg/μl in sputum. The cut off value was 0.092 in urine, 0.110 in plasma, 0.090 in PBMC, 0.081 in pleural fluid and 0.164 in sputum. The sensitivity ranged from 55.5% in plasma to 75.0% in pleural fluid. The specificity varied from 51.5% in urine to 100% in pleural fluid. The kappa between colorimetric detection and agarose gel was substantial in the sputum. It is concluded that, although the sensitivity and specificity vary greatly, it may be useful for the diagnosis of TB. To validate the results, it is necessary to analyze a larger number of biological samples.
Keywords: Tuberculosis
Molecular diagnostic techniques
Polimerase chain reaction
keywords: Tuberculose
Técnicas de diagnóstico molecular
Reação em cadeia da polimerase
DeCS: Tuberculose
Diagnóstico
Técnicas de diagnóstico molecular
Estudos de Casos e Controles
Reação em cadeia da polimerase
métodos
Tuberculose
microbiologia
Mycobacterium tuberculosis
isolamento & purificação
Escarro
microbiologia
DNA Bacteriano
Análise
Sensibilidade e Especificidade
Issue Date: 2017
Citation: SALAZAR, Marcela Pereira. Avaliação da Nested PCR em único tubo colorimétrica em diferentes amostras biológicas de pacientes com tuberculose. 2017. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Saúde Pública) – Instituto Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2017.
Date of defense: 2017-05-30
Place of defense: Recife/PE
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães.
Program: Programa de Pós-Graduação em Saúde Pública
Copyright: restricted access
Appears in Collections:PE - IAM - PPGSP - Dissertações de Mestrado

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