Desenvolvimento de um método diagnóstico diferencial para Bordetella Pertussis usando reagentes produzidos no Brasil

Abstract

A coqueluche é uma doença infecciosa causada por bactérias do gênero Bordetella. Atualmente, o teste diagnóstico padrão-ouro é a cultura obtido através de swab nasal profundo. No entanto, sendo uma bactéria fastidiosa, a cultura torna-se um exame demorado, dificultando o tratamento correto. Neste projeto, realizamos a padronização e otimização de um teste de diagnóstico multiplex, baseado em PCR em Tempo Real (qPCR), capaz de detectar, discriminar e identificar as principais espécies de Bordetella patogênicas para humanos. O teste também foi padronizado no formato gelificado, o que permite eliminar a cadeia de transporte e armazenamento refrigerado. A detecção de alvos no genoma humano (rRNA 18S ou RNaseP) foi usada para garantir a funcionalidade do sistema, avaliando a qualidade do DNA extraído, a presença de inibidores e a integridade dos reagentes. Seguindo a política do Governo Federal de fortalecimento do Parque Tecnológico da Saúde, o presente teste foi desenvolvido com insumos produzidos pelo Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP/Fiocruz-PR), contribuindo para a redução dos custos de produção. Os resultados indicam que os reagentes nacionais permitem a mesma eficiência de reação que os reagentes importados, quando analisados no formato líquido da reação. A reação gelificada exibe a mesma sensibilidade que o formato tradicional, capaz de detectar até 0,02 genomas equivalentes da bactéria. Obtivemos sucesso na eliminação de contaminação ambiental por amplicons com a adição de UNG nas reações líquidas. A avaliação do teste foi realizada com amostras previamente caracterizadas e cedidas pelo LACEN-PR. O uso de um kit de diagnóstico baseado em qPCR confere agilidade e sensibilidade analítica necessárias ao diagnóstico preciso da doença, contribuindo para o manejo clínico adequado do paciente.