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Title: Desenvolvimento de um método diagnóstico diferencial para Bordetella Pertussis usando reagentes produzidos no Brasil
Advisor: Morello, Luis Gustavo
Costa, Alexandre Dias Tavares
Members of the board: Raboni, Sonia Mara
Fragoso, Stenio Perdigao
Carneiro, Flavia Raquel Gonçalves
Authors: Polak, Najua Mohamad Zahra
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: A coqueluche é uma doença infecciosa causada por bactérias do gênero Bordetella. Atualmente, o teste diagnóstico padrão-ouro é a cultura obtido através de swab nasal profundo. No entanto, sendo uma bactéria fastidiosa, a cultura torna-se um exame demorado, dificultando o tratamento correto. Neste projeto, realizamos a padronização e otimização de um teste de diagnóstico multiplex, baseado em PCR em Tempo Real (qPCR), capaz de detectar, discriminar e identificar as principais espécies de Bordetella patogênicas para humanos. O teste também foi padronizado no formato gelificado, o que permite eliminar a cadeia de transporte e armazenamento refrigerado. A detecção de alvos no genoma humano (rRNA 18S ou RNaseP) foi usada para garantir a funcionalidade do sistema, avaliando a qualidade do DNA extraído, a presença de inibidores e a integridade dos reagentes. Seguindo a política do Governo Federal de fortalecimento do Parque Tecnológico da Saúde, o presente teste foi desenvolvido com insumos produzidos pelo Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP/Fiocruz-PR), contribuindo para a redução dos custos de produção. Os resultados indicam que os reagentes nacionais permitem a mesma eficiência de reação que os reagentes importados, quando analisados no formato líquido da reação. A reação gelificada exibe a mesma sensibilidade que o formato tradicional, capaz de detectar até 0,02 genomas equivalentes da bactéria. Obtivemos sucesso na eliminação de contaminação ambiental por amplicons com a adição de UNG nas reações líquidas. A avaliação do teste foi realizada com amostras previamente caracterizadas e cedidas pelo LACEN-PR. O uso de um kit de diagnóstico baseado em qPCR confere agilidade e sensibilidade analítica necessárias ao diagnóstico preciso da doença, contribuindo para o manejo clínico adequado do paciente.
Abstract: Whooping cough is an infectious disease caused by bacteria of the Bordetella genus. Currently, the gold-standard diagnostic test is the culture obtained from deep nasal swab. However, being a fastidious organism, culturing becomes a time-consuming test, hampering the correct treatment. In this project, we performed the standardization and optimization of a multiplex diagnostic test, based on Real Time PCR (qPCR), able to detect, discriminate and identify the main species of Bordetella that are pathogenic to humans. The test was also standardized in a gelified format, which allows the elimination of the cold chain during transportation and storage. Detection of human genomic targets (18S rRNA or RNaseP) was used to ensure the functionality of the system, assessing the quality of the extracted DNA, the presence of inhibitors and the integrity of reagents. In line with the federal government policies to strengthen the Health Technological Sector, the present test was developed using reagents produced by the Molecular Biology Institute of Parana (IBMP/Fiocruz-PR), thus contributing to the reduction of production costs. The results indicate that local reagents allow for similar reaction efficiencies as the imported ones, when analyzed in the reaction’s liquid format. The gelified reaction exhibits the same sensitivity as the traditional format, capable of detecting up to 0.02 bacterial genome equivalents. We succeeded in eliminating environmental contamination caused by amplicons with the addition of UNG in the liquid reactions. The evaluation of the test was performed using samples previously characterized by LACEN-PR. The use of a qPCR-based diagnostic kit confers agility and sensitivity for an accurate diagnosis of the disease, contributing to the proper clinical management of the patient.
Keywords: Whooping Cough
Respiratory Tract Diseases
Diagnosis
keywords: Genética Fisiológica
DeCS: Doenças do Sistema Respiratório
Diagnóstico Diferencial
Coqueluche
Bordetella pertussis
Issue Date: 2017
Citation: POLAK, Najua Mohamad Zahra. Desenvolvimento de um método diagnóstico diferencial para Bordetella Pertussis usando reagentes produzidos no Brasil. 2017. 69 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas, 2017, Curitiba, 2017.
Date of defense: 2017
Place of defense: Curitiba
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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