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Title: Caracterização de componentes da via TOR (target of rapamycin) em Trypanosoma cruzi
Advisor: Holetz, Fabíola Barbieri
Goldenberg, Samuel
Members of the board: Morking, Patricia Alves
Fragoso, Stenio Perdigao
Reifur, Larissa
Authors: Miot, Hálisson Tesseroli
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: Uma das vias de sinalização mais estudada nos últimos anos, é a via TOR (target of rapamycin), um importante sensor nutricional presente em eucariotos. O efeito da rapamicina é dependente de sua interação com a proteína FKBP12 que por sua vez, interage com a proteína TOR, impedindo o acesso da mesma aos seus substratos. Por meio de identificação in silico demonstramos a existência dos genes TOR1, TOR2, TOR-like1, TOR-like2, Raptor, AVO3, Raptor-like e FKBP12 em Trypanosoma cruzi. O tratamento das formas epimastigotas com rapamicina induziu expressiva alteração morfológica e redução da proliferação celular, corroborando a presença desta via no parasita. Os genes foram clonados, as proteínas foram expressas, purificadas e inoculadas em camundongos e coelhos para obtenção de anticorpos. Apenas o anticorpo para a proteína FKBP12 apresentou alta especificidade e foi demonstrado através de ensaio de imunofluorescência indireta que esta proteína localiza-se no núcleo, e confirmado através de western blot com extrato da fração nuclear do parasita. Através de ensaios de imunoprecipitação em parasitas não-tratados, tratados com rapamicina e parasitas submetidos a estresse nutricional e posterior análise por espectrometria de massas, identificamos os complexos proteicos que se associam com a proteína FKBP12. Proteínas como Hsp90, H2A, proteínas ribossomais e de ligação à RNA foram identificadas, demonstrando que a proteína FKBP12 está envolvida na biogênese de ribossomos, modificação da estrutura da cromatina e transporte de mRNA. Foi visto ainda que o processo de tradução parece estar sendo afetado após o tratamento com 5 μg/mL de rapamicina, pois houve uma redução de proteínas envolvidas com esse evento identificadas no experimento de imunoprecipitação. Foi realizado o knock-out de um alelo do gene da proteína FKBP12 e a sua confirmação ainda será realizada. O fracionamento dos extratos proteicos de parasitas em gradiente de sacarose mostraram a mobilização da proteína ribossomal S6 da fração polissomal para as frações leves, quando os parasitas foram tratados com rapamicina e submetidos a estresse nutricional. Este resultado sugere que nestas condições, a via TOR esteja inibida, e a proteína ribossomal S6, um dos alvos desta via, não está fosforilada, consequentemente, afetando o processo de tradução celular.
Abstract: One of the most signaling pathways studied in recent years, is TOR pathway (Target Of Rapamycin), an important nutritional sensor present in eukaryotes. The effect of rapamycin is dependent on its interaction with FKBP12 protein which in turn, interacts with the TOR protein, preventing the access to its substrates. Through in silico identification demonstrate the existence of TOR1, TOR2, TOR-like1, TOR-like2, Raptor, AVO3, Raptor-like and FKBP12 in Trypanosoma cruzi genes. Preliminary data showed that the treatment of epimastigotas forms with rapamycin induced morphological changes and reduction of cell proliferation, reinforcing the presence of this pathway in the parasite. These genes were cloned, the proteins were expressed, purified, and inoculated in mice to produce antibodies. Only the antibody to FKBP12 protein showed high specificity and was demonstrated by indirect immunofluorescence assay that this protein is located in the nucleus, and confirmed by western blot with nuclear extract fraction of the parasite. Through immunoprecipitation assays in untreated parasites, parasites treated with rapamycin and subjected to nutritional stress and subsequent analysis by mass spectrometry, we identified the protein complexes that associate with FKBP12 protein. Proteins like Hsp90, H2A, ribosomal proteins and RNA binding were identified, thus demonstrating that the FKBP12 protein is involved in ribosome biogenesis, modification of chromatin structure and mRNA transport. It was also seen that the process of translation seems to be affected after treatment with 5 mg/mL rapamycin, because there was a reduction of proteins involved with this event identified in immunoprecipitation experiments. The knock-out was conducted of an allele of the FKBP12 protein gene and its confirmation will still be held. The fractionation of protein extracts of parasites sucrose gradient showed the mobilization of ribosomal protein S6 polysomal fraction to light fractions, where the parasites were treated with rapamycin and subjected to nutritional stress. This result suggests that under these conditions the TOR pathway is inhibited, and the ribosomal protein S6, one of the targets of this pathway is not phosphorylated, thus affecting the process of cell translation.
Keywords: Molecular Biology
TOR Serine-Threonine Kinases
Sirolimus
Guanosine Diphosphate Mannose
keywords: Trypanosoma cruzi
DeCS: Biologia Molecular
Guanosina Difosfato Manose
Sirolimo
Serina-Treonina Quinases TOR
Issue Date: 2014
Publisher: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas.
Citation: MIOT, Hálisson Tesseroli. Caracterização de componentes da via TOR (target of rapamycin) em Trypanosoma cruzi. 2014. 191 f. Dissertação (Mestrado em Biociencias e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, 2014.
Date of defense: 2014
Place of defense: Curitiba/PR
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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