Localização subcelular da actina 2 em Trypanosoma cruzi: Produção de soro policlonal e de parasitas transfectantes

Abstract

O protozoário Trypanosoma cruzi possui um citoesqueleto diferenciado, baseado em um arcabouço de microtúbulos subpeliculares. Entretanto, o papel de outros componentes do citoesqueleto, como a actina, ainda permanece pouco explorado. Até o momento foram identificados no genoma de T. cruzi ao menos quatro genes codificadores para diferentes isoformas dessa proteína. No entanto, uma caracterização completa dessas isoformas ainda não foi realizada. Neste contexto, a presente dissertação teve por objetivo determinar a expressão e imunolocalização específica de uma das isoformas de actina, a actina 2. A partir de análise in silico encontramos que a actina 2 é uma isoforma exclusiva de T. cruzi, com 51% de identidade quando comparada à isoforma mais conservada em eucariontes (actina 1). Para obtenção do soro policlonal, uma sequência de 14 aminoácidos correspondente a uma região não conservada da actina 2 foi utilizada para imunizar camundongos. Ensaios de imunofluorescência demonstraram que a actina 2 é distribuída por todo o corpo celular do parasita, predominantemente na região perinuclear em formas epimastigotas. Em formas tripomastigotas uma minoria das células demonstrou essa marcação perinuclear, enquanto que em amastigotas a marcação mostrou-se dispersa pelo corpo do parasita. Ainda, a sequência da actina 2 foi inserida em um cassete baseado na tecnologia Gateway, contendo a etiqueta comercial FLAG (nas posições C e N-terminal) ou GFP. Os cassetes foram transfectados em formas epimastigotas e, após seleção, a presença do cassete foi confirmada por Western blot e PCR. A localização subcelular por imunofluorescência indireta da etiqueta FLAG (C-terminal) mostrou que a inserção da etiqueta não afetou o endereçamento da proteína, quando comparado aos resultados obtidos com o soro policlonal, diferentemente das outras construções obtidas. Ensaio de imunomarcação de formas epimastigotas por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou uma marcação dispersa pelo corpo do parasita, confirmando os resultados obtidos por imunofluorescência. Nossos resultados indicam que o uso de parasitas geneticamente modificados e de anticorpos policlonais específicos permite uma avaliação mais precisa da imunolocalização de diferentes isoformas de uma mesma proteína de T. cruzi. Além disso, a imunolocalização da actina 2 difere daquela obtida com actina 1 por outros autores, que demonstraram uma marcação dispersa por todo o corpo do parasita, sugerindo assim que essas isoformas podem ter funções diferentes. Nossos dados abrem um leque de possibilidades no estudo da localização subcelular e função de cada uma das isoformas de actina de T. cruzi.