Please use this identifier to cite or link to this item: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/23856
Title: Localização subcelular da actina 2 em Trypanosoma cruzi: Produção de soro policlonal e de parasitas transfectantes
Advisor: Soares, Maurilio José
Medeiros, Lia Carolina Soares
Members of the board: Rocha, Wanderson Duarte da
Iriane, Eger
Picchi, Gisele Fernanda Assine
Authors: Borges, Beatriz Santana
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: O protozoário Trypanosoma cruzi possui um citoesqueleto diferenciado, baseado em um arcabouço de microtúbulos subpeliculares. Entretanto, o papel de outros componentes do citoesqueleto, como a actina, ainda permanece pouco explorado. Até o momento foram identificados no genoma de T. cruzi ao menos quatro genes codificadores para diferentes isoformas dessa proteína. No entanto, uma caracterização completa dessas isoformas ainda não foi realizada. Neste contexto, a presente dissertação teve por objetivo determinar a expressão e imunolocalização específica de uma das isoformas de actina, a actina 2. A partir de análise in silico encontramos que a actina 2 é uma isoforma exclusiva de T. cruzi, com 51% de identidade quando comparada à isoforma mais conservada em eucariontes (actina 1). Para obtenção do soro policlonal, uma sequência de 14 aminoácidos correspondente a uma região não conservada da actina 2 foi utilizada para imunizar camundongos. Ensaios de imunofluorescência demonstraram que a actina 2 é distribuída por todo o corpo celular do parasita, predominantemente na região perinuclear em formas epimastigotas. Em formas tripomastigotas uma minoria das células demonstrou essa marcação perinuclear, enquanto que em amastigotas a marcação mostrou-se dispersa pelo corpo do parasita. Ainda, a sequência da actina 2 foi inserida em um cassete baseado na tecnologia Gateway, contendo a etiqueta comercial FLAG (nas posições C e N-terminal) ou GFP. Os cassetes foram transfectados em formas epimastigotas e, após seleção, a presença do cassete foi confirmada por Western blot e PCR. A localização subcelular por imunofluorescência indireta da etiqueta FLAG (C-terminal) mostrou que a inserção da etiqueta não afetou o endereçamento da proteína, quando comparado aos resultados obtidos com o soro policlonal, diferentemente das outras construções obtidas. Ensaio de imunomarcação de formas epimastigotas por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou uma marcação dispersa pelo corpo do parasita, confirmando os resultados obtidos por imunofluorescência. Nossos resultados indicam que o uso de parasitas geneticamente modificados e de anticorpos policlonais específicos permite uma avaliação mais precisa da imunolocalização de diferentes isoformas de uma mesma proteína de T. cruzi. Além disso, a imunolocalização da actina 2 difere daquela obtida com actina 1 por outros autores, que demonstraram uma marcação dispersa por todo o corpo do parasita, sugerindo assim que essas isoformas podem ter funções diferentes. Nossos dados abrem um leque de possibilidades no estudo da localização subcelular e função de cada uma das isoformas de actina de T. cruzi.
Abstract: The protozoan Trypanosoma cruzi presents a differentiated cytoskeleton, based on a sub-pellicular corset of microtubules. However, the role of other cytoskeleton components, such as actin, still remains poorly understood. Up to now at least four genes coding different isoforms of this protein were found in the genome of T. cruzi, but a full characterization of these isoforms has not yet been performed. In this context, the present dissertation aimed to determine the expression and specific immunolocalization of one of the actin isoforms. By in silico analysis we found that actin 2 is an exclusive isoform of T. cruzi, with 51% identity when compared with the most conserved isoform of other eukaryotic cells (actin 1). Thus, a sequence of 14 amino acids corresponding to a non-conserved region of actin 2 was used to immunize mice in order to obtain a polyclonal serum. Immunofluorescence assay showed that actin 2 is distributed throughout the cell body of the parasites, mainly in the perinuclear region of epimastigotes. In trypomastigotes few parasites showed this perinuclear localization, while in amastigotes labeling was found dispersed through the cell body. Furthermore, the sequence of actin 2 was inserted into a cassette based on the Gateway technology containing a commercial tag FLAG (both C and N-terminal) or GFP. The cassettes were transfected into epimastigote forms and after selection, the cassette presence was confirmed by Western blot and PCR. Subcellular localization by immunofluorescence of the C-terminal FLAG tag showed that insertion of the label did not affect the addressing of the protein, when compared to the results obtained with polyclonal serum, unlike the other obtained constructs. Immunolocalization assays with epimastigotes demonstrated labeling dispersed through the parasite body, confirming the results obtained by immunofluorescence. Our results indicate that use of genetically modified parasites and specific polyclonal antibodies allow a more precise immunolocalization of different isoforms of the same protein in T. cruzi. Furthermore, immunolocalization of actin 2 differs from that obtained by other authors with actin 1 (dispersed in the cytoplasm), suggesting that these isoforms may have different cellular functions. Our data open up a range of possibilities in the study of subcellular localization and function of each one of the actin isoforms in T. cruzi.
Keywords: Chagas Disease
Actins
Actin Cytoskeleton
Parasitolology
keywords: Trypanosoma cruzi
Trypanosoma rangeli
DeCS: Doença de Chagas
Actinas
Citoesqueleto de Actina
Parasitologia
Issue Date: 2016
Publisher: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas.
Citation: BORGES, Beatriz Santana. Localização subcelular da actina 2 em Trypanosoma cruzi: Produção de soro policlonal e de parasitas transfectantes. 2016. 77 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas, 2016, Curitiba, 2016.
Date of defense: 2016
Place of defense: Curitiba/PR
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Dissert_Beatriz_Borgesok.pdf1.9 MBAdobe PDFView/Open


FacebookTwitterDeliciousLinkedInGoogle BookmarksBibTex Format mendeley Endnote DiggMySpace

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.