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Title: Análise de proteínas de ligação ao RNA com o domínio dedo de zinco ZFP29 e ZFPTTP em Trypanosoma cruzi
Advisor: Alves, Lysangela Ronalte
Goldenberg, Samuel
Members of the board: Muniz, Bruno Dallagiovanna
Picchi, Gisele Fernanda Assine
Authors: Romagnoli, Bruno Accioly Alves
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: A regulação da expressão gênica é essencial para que o Trypanosoma cruzi se adapte às diferentes condições impostas pelos seus hospedeiros durante seu ciclo de vida. Nos tripanossomatídeos esse controle é mediado principalmente por mecanismos pós-transcricionais, os quais atuam no metabolismo dos mRNAs e das proteínas. Nesse contexto, as proteínas de ligação ao RNA (RBPs) são componentes-chave, uma vez que interagem com os mRNAs durante todas as etapas de controle coordenando seus destinos na célula. São também capazes de se ligar a outras proteínas, formando complexos ribonucleoproteicos (mRNPs). Existem diferentes grupos de proteínas que compõem o repertório de RBPs no T. cruzi, entre elas as que apresentam o domínio dedo de zinco CCCH. Estudos anteriores com as proteínas ZFP29 e ZFPTTP s que apresentam esse domínio demonstraram que ambas têm sua expressão regulada ao longo do ciclo de vida do parasita, não sendo expressas nas formas tripomastigotas metacíclicas. Esse trabalho visou então analisar a regulação das proteínas ZFP29 e ZFPTTP na metaciclogênese e sua participação em complexos mRNPs. As proteínas ZFP29 e ZFPTTP são reguladas a partir das formas aderidas, tendo sido observado que ZFP29 não é detectada, enquanto na ZFPTTP a expressão é drasticamente reduzida. As proteínas ZFP29-FLAG e ZFPTTP-FLAG não apresentaram o mesmo controle observado para as proteínas nativas nas formas aderidas, no entanto, também foram reguladas negativamente no estágio metacíclico. Ao analisar a expressão dos mRNAs das proteínas ZFP29 e ZFPTTP por qPCR na metaciclogênese, foi observado que o transcrito de ZFPTTP é constantemente expresso, enquanto que o de ZFP29 foi reduzido apenas nas formas metacíclicas. Esses resultados indicam a possibilidade de haver diferentes mecanismos regulatórios atuando no nível de transcrito e/ou proteína para controlar a expressão de ZFP29 e ZFPTTP em diversos estágios da metaciclogênese. Essas duas proteínas são citoplasmáticas em epimastigotas e, enquanto ZFP29 mantém essa localização nos parasitas estressados, ZFPTTP aparenta localizar-se também no núcleo durante o estresse. Os parasitas expressando ZFP29-FLAG apresentaram alterações na diferenciação, mas não no crescimento. Já a expressão de ZFPTTP-FLAG provocou mudanças tanto na diferenciação quanto no crescimento. Ensaios de imunoprecipitação dos complexos mRNPs associados a ZFP29-FLAG e ZFPTTP-FLAG foram realizados em epimastigotas e nos parasitas submetidos ao estresse. No caso da proteína ZFP29-FLAG, foram encontrados mRNAs que codificam para proteínas de superfície, proteínas motoras e proteínas hipotéticas. A diferença entre as populações em epimastigotas e nos parasitas em estresse aponta que ZFP29 forma diferentes complexos mRNPs em cada uma dessas duas condições. Para a proteína ZFPTTP-FLAG mais de 40% dos transcritos codificam proteínas ribossomais, sugerindo uma função de ZFPTTP relacionada à tradução. Esse estudo reforça a teoria dos RNA regulons atuando no controle da expressão gênica em T. cruzi, aprofundando o conhecimento para a formação de redes de regulação pós-transcricionais nesse parasita.
Abstract: The regulation of gene expression is essential to adapt Trypanosoma cruzi to different conditions imposed by their hosts during their life cycle. In trypanosomatids, this control is mainly mediated by post-transcriptional mechanisms which act on the metabolism of the mRNAs and proteins. In this context, the RNA binding proteins (RBPs) are key players since they interact with the mRNA during all control stages, by coordinating their destinations in the cell. They are also capable of binding to other proteins, forming ribonucleoproteics complex (mRNPs). The RBPs repertoire in T. cruzi comprises different groups of proteins, including those with the CCCH zinc finger domain. Earlier studies with two proteins which exhibit this domain - ZFP29 and ZFPTTP - demonstrated that both of them have their expression regulated during the parasite life cycle, not being expressed in the metacyclic trypomastigotes forms. Thus, this study aimed to analyze the regulation of ZFP29 and ZFPTTP proteins in metacyclogenesis and their participation in mRNPs complex. The ZFP29 and ZFPTTP proteins are regulated by the adhered forms, having been observed that ZFP29 is not detected, while in ZFPTTP the expression is dramatically reduced. The ZFP29-FLAG and ZFPTTP-FLAG proteins did not have the same control observed for the native proteins in the adhered forms, however, they were also negatively regulated in metacyclic stage. By analyzing the mRNAs expression of ZFP29 and ZFPTTP proteins by qPCR in metacyclogenesis, it was observed that the ZFPTTP transcript is constantly expressed, while the ZFP29 was reduced only in the metacyclic forms. These results indicate the possibility of different regulatory mechanisms acting on the transcript and/or protein level to control the expression of ZFP29 and ZFPTTP at different metacyclogenesis stages. These two proteins are cytoplasmic epimastigotes and while ZFP29 keeps this location in stressed parasites, ZFPTTP appears to be located also at the nucleus during stress. Parasites that expressed ZFP29-FLAG, showed changes in differentiation, but not in the growth. On the other hand, ZFPTTP-FLAG expression resulted in changes both in differentiation and growth. Immunoprecipitation assays of mRNPs complex associated with ZFP29-FLAG and ZFPTTP-FLAG were performed in epimastigotes and also in parasites subjected to stress. In the case of ZFP29 -FLAG protein, there were found mRNAs that encode surface proteins, motor proteins and hypothetical proteins. The difference between populations in epimastigotes and stressed parasites indicates that ZFP29 forms different mRNPs complex in each of these two conditions. For ZFPTTP-FLAG, more than 40% of the transcripts encode ribossomal proteins, suggesting a ZFPTTP function related to the translation. This study reinforces the theory of RNA regulons acting in the control of gene expression in T. cruzi, having deepened the knowledge about the formation of post transcriptional regulatory networks in this parasite.
Keywords: Chagas Disease
Gene Expression
RNA-Binding Proteins
Parasitology
keywords: Trypanosoma cruzi
Trypanosoma brucei
Regulon
DeCS: Doença de Chagas
Expressão Gênica
Proteínas de Ligação a RNA
Parasitologia
Issue Date: 2016
Publisher: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas.
Citation: ROMAGNOLI, Bruno Accioly Alves. Análise de proteínas de ligação ao RNA com o domínio dedo de zinco ZFP29 e ZFPTTP em Trypanosoma cruzi. 2016. 234 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas, 2016, Curitiba, 2016.
Date of defense: 2016
Place of defense: Curitiba/PR
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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