Implementação de uma metodologia para genotipagem da região promotora do gene do TNF-a e sua aplicação em uma população exposta à sílica

Abstract

A silicose é uma pneumoconiose provocada pela inalação da poeira de sílica e consiste em uma lesão pulmonar com participação de citocinas como o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α). Há dois polimorfismos nos sítios -238 e -308 do promotor do gene da TNF-α (substituição de uma guanina por uma adenina) que têm sido investigados como possíveis fatores de susceptibilidade para a silicose. A mutação na posição -308 tem sido associada com altos níveis da citocina no sangue, enquanto que a posição -238, com formas mais graves da doença. A exposição ocupacional à sílica continua sendo um problema de Saúde Pública no Brasil. O Centro de Estudos de Saúde do Trabalhador e Ecologia Humana (CESTEH)/FIOCRUZ acompanha trabalhadores do Rio de Janeiro expostos à sílica. Este trabalho teve como objetivo a implementação de uma metodologia para determinação do polimorfismo dos sítios -308 e -238 do promotor da TNF-α para futura utilização na avaliação da exposição à sílica. A genotipagem foi feita através da técnica de PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restricition Fragment Length Polymorphism) usando NcoI para -308 e BamHI para -238. Foram realizados ensaios para a implementação da metodologia, sendo esta aplicada em uma amostra populacional de 79 trabalhadores assistidos no ambulatório do CESTEH, sendo todos do sexo masculino e maiores de 18 anos. Como resultados foram fixadas as seguintes condições (para ambos os sítios): 100ng de DNA extraído de 500µL de sangue total é utilizado como molde para a PCR, junto com 1,5U de Taq-DNA Polimerase Recombinante em um volume final de 50µL. Como primers, foram usados: 5'AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT e 5'TCCTCCCTGCTCCGATTCCG como senso e antisenso para -308 e 5'AAACAGACCACAGACCTGGTC e 5'CTCACACTCCCCATCCTCCCGGATC para -238. Os parâmetros da PCR para – 308 foram: 35 ciclos de 94ºC/40s, 60ºC/50s e 72ºC/60s, gerando um fragmento de 107pb; sítio –238: 35 ciclos de 94ºC/40s, 58ºC/90s e 72ºC/60s, gerando um fragmento de 165 pb. Na digestão foi utilizada a proporção de 5U da enzima para cada 1µg de DNA, sendo incubada a 37ºC por 1 hora. Os indivíduos com o alelo mutante perdem o sítio atacado pela enzima de restrição. Os trabalhadores genotipados para o sítio - 308 apresentaram 16,4% (n=13) para o genótipo GA, 82,3% (n=65) para GG e 1,3% (n=1) para o genótipo AA. O sítio –238 apresentou as frequências de 2,3% (n=2) para GA, 97,7% (n=77) para GG e zero para AA. Nesse estudo, demonstrou-se que a presença do alelo mutante (A) está associada a maiores quantidades da citocina no sangue. Não foram encontradas diferenças significativas entre as médias da enzima GST e a presença ou não do alelo mutante. A presença do alelo -308A apresentou ainda um risco relativo de 3,697 para o desenvolvimento de silicose. A implementação de um método toxicogenético permite a identificação de possíveis determinantes de suscetibilidade individual ao desenvolvimento da doença, aumentando o alcanço das avaliações da saúde do trabalhador.