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Title: Caracterização da resposta imune celular em cães frente a novos antígenos de Leishmania infantum
Other Titles: Characterization of the cellular immune response in dogs opposite to new antigens of Leishmania infantum
Advisor: Cavalcanti, Milena de Paiva
Members of the board: Cavalcanti, Milena de Paiva
Xavier, Danilo Elias
Castro, Maria Carolina Accioly Brelaz de
Authors: Silva, Lays Adrianne Mendonça Trajano
Coadvisor: Lorena, Virginia Maria Barros de
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Abstract: A resposta imune na Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é importante para o controle e a cura da infecção. Dentro desse contexto, proteínas que estimulam um perfil do tipo Th1, tem sidoexplorada como candidatos vacinais. Desta forma, o objetivo deste estudo foiavaliar a resposta imune celular decães frente a novas proteínas recombinantes, para obtenção de subsídios científicos que direcionem estudos de vacinologia. Para isto amostras de sangue de cães com LV residentes em área endêmica em Pernambuco foram coletadas. Um estudo piloto foi realizado para escolha dos estímulos in vitro, bem como concentrações antigênicas e tempo de cultivo. Após separação das células mononucleares do sangue periférico (PBMC), as células foram submetidas ao estímulo com antígenos Lci10, Lci13 e a proteína quimérica Q1 nas concentrações de 2,5µg/mL, 5µg/mL e 10µg/mL, e antígeno bruto solúvel de L. infantum (LSA) nas concentrações de 10µg/mL e 25µg/mL por 24h, 48h e 72h. Ao fim do tempo de cultivo o RNA total foi extraído e uma transcrição reversa para cDNA foi realizada para avaliação da expressão gênica para as citocinas IFN-γ, TNF, IL-2, IL-4, IL-10 e TGF-β através do método de Ct comparativo por RT-PCR em tempo real. Para o LSA a concentração de 25µg/mL foi escolhida, por apresentar uma melhor expressão das citocinas tanto do perfil Th1, quanto Th2. O PBMC que foi estimuladocom a Lci13 (5µg/mL em 24h de cultivo),apresentou um o perfil protetor (Th1) quando comparado com o LSA. Por esta razão, este antígeno foi escolhido para análise nos grupos de estudo. Após, estabelecimento das condições de cultivo, 19 cães foram incluídos em nosso estudo, sendo 7 para o grupo controle, 7 para o grupo sintomático e 5 para o grupo assintomático. Foi observado que apesar de não haver diferenças estatísticas significativas entre os grupos analisados, de forma descritiva o estímulo da Lci13 em animais controle foi bastante promissor, com a expressão positiva para IFN-ɣ e TNF, além da presença da IL-10 atuando como regulador da resposta imune, e uma expressão negativa para TGF-β. Além disso, a correlação entre IFN-ɣ e TNF (p=0,042) e IFN-ɣ e IL-10 (p=0,049) foi significativa e indicou uma forte correlação positiva entre as citocinas. Para os grupos sintomáticos e assintomáticos apenas o TNF foi expresso de forma positiva, havendo uma supressão de TGF-β. A partir dos resultados obtidos, o estudo foi capaz de fornecer subsídios científicos com relação a imunologia na LVC. O antígeno Lci13 em cães controle apresentou um bom desempenho, abrindo espaço para novas pesquisas para desenvolvimento de uma vacina profilática.
Abstract: The immune response in Visceral Canine Leishmaniasis (VCL) is important for the control and cure of infection. In this regards, proteins that stimulate a Th1-type profile have been explored as vaccine candidates. In this way, the objective of this study was to evaluate the cellular immune response of dogs against new recombinant proteins, to obtain scientific subsidies that guide vaccination studies. For this, blood samples from dogs with LV residing in an endemic area in Pernambuco was performed. A pilot study was conducted to select in vitro stimuli, as well as antigenic concentrations and culture time. After separation ofPeripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC), the cells were challenged with Lci10, Lci13 antigens and Q1 chimeric protein atthe 2.5μg/mL, 5μg/mL and 10μg/mL, and soluble crude antigen from L. infantum (LSA) at 10μg/mL and 25μg/mL for 24h, 48h and 72h. At the end of the culture time the total RNA was extracted and a cDNA reverse transcriptase was performed to evaluate the gene expression for the cytokines IFN-γ, TNF, IL-2, IL-4, IL-10 and TGF-β, through comparative Ct method by RT-PCR in real time. For the LSA, the concentration of 25μg/mL was chosen, since it had a better expression of the cytokines of both Th1 and Th2 profiles. PBMC cultures challenged with Lci13 antigen (5μg/mL, 24h) presented the best protective cytokines expression profile (Th1) compered to LSA. For this reason this antigen was choosen for futher analyses on studied dogs groups. After the establishment of culture conditions, 19 dogs were included in our study, 7 for the control group, 7 for the symptomatic group and 5 for the asymptomatic group. Although there were no statistically diference between analyzed groups,animal challenged with Lci13 demonstrated to be very promissing with positive expression. For IFN-ɣ and TNF. In addition, this dogs also presented IL-10 acting, as regulator of the immune response, and a negative expression for TGF-b. The correlation between IFN-ɣ and TNF (p = 0.042) and IFN-ɣ and IL-10 (p = 0.049) was significantindicating a positive correlation between the cytokines. For the symptomatic and asymptomatic groups only TNF was expressed positively, with a suppression of TGF-β. From the results obtained, the study was able to provide scientific subsidies regarding the immunology of VCL. The Lci13 antigen in control dogs presented a good performance, open field for further researchson develop a prophylactic vaccine.
Keywords: Canine Visceral Leishmaniasis
Recombinant antigens
Immune response
keywords: Leishmaniose Visceral Canina
Antígenos recombinantes
Resposta imune
DeCS: Leishmaniose Visceral/imunologia
Leishmania infantum
Cães
Antígenos de Protozoários
Proteínas Recombinantes
Sangue/parasitologia
Células Th1/imunologia
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo
Real/métodos
Issue Date: 2017
Citation: SILVA, Lays Adrianne Mendonça Trajano. Caracterização da resposta imune celular em cães frente a novos antígenos de Leishmania infantum. 2017. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia em Saúde) – Instituto Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2017.
Date of defense: 2017-10-20
Place of defense: Recife/PE
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães.
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia em Saúde
Copyright: open access
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