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Title: Caracterização fenotípica e molecular dos vírus quiméricos febre amarela / dengue candidatos a uma vacina tetravalente recombinante contra dengue
Advisor: Motta, Márcia Christina Vasconcelos Archer da
Campos, Elena Cristina Caride Siqueira
Authors: Mendes, Luiz Gustavo Almeida
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: A infecção pelo vírus da dengue é um problema de saúde pública mundial, com epidemias recorrentes nas regiões tropicais da Ásia, África e Américas. O desenvolvimento de vacinas contra dengue é de suma importância, já que até o momento não existem vacinas licenciadas. Nossa intenção final é a de podermos desenvolver uma vacina mista recombinante contra dengue a partir do clone infeccioso do vírus da febre amarela, linhagem vacinal 17D. Isso foi realizado através da troca dos genes estruturais prM/E do vírus da febre amarela pelos respectivos genes do vírus dengue dos sorotipos 1, 2, 3, e 4. Neste trabalho descrevemos as características genotípicas e fenotípicas dos vírus recombinantes Febre Amarela/Dengue construídos anteriormente. Esta caracterização consiste em observar o comportamento desse vírus quanto ao fenótipo de placa de lise, crescimento em cultura de células Vero em meio sem soro, replicação em Cell Factory (média escala), estabilidade genética, seleção clonal, teste de neurovirulência e proteção em modelo murino. As construções dos vírus recombinantes YFV/DENV prM/E são viáveis, produzindo vírus que replicam eficientemente em garrafas estacionárias T-175cm² e Cell Fatory, com propriedades de replicação similares aos vírus dengue selvagens parentais, sugerindo que a troca da prM/E de febre amarela pela mesma região de dengue é capaz de afetar esta característica fenotípica do vírus YFV17D Após a etapa de purificação clonal os clones foram sequenciados e comparados com o lote de trabalho P2. Esta comparação revelou algumas alterações de aminoácido entre as passagens P2 e CP2 em todos os clones, exceto para os clones YFV/DENV4. Os clones CP2 foram propagados por mais oito vezes em célula Vero para determinar se os vírus eram geneticamente estáveis. Após as passagens observamos que muitas alterações foram de caráter adaptativo à célula Vero. Os clones foram caraterizados pela morfologia de placa de lise e revelados por imunofocus. Os clones YFV/DENV1 (PE), YFV/DENV2 (PE), YFV/DENV4 demonstram ser homogênios e o clone YFV/DENV3 H87 heterogêneo. Com o objetivo de avaliar o neurotropismo dos clones virais, foram realizados dois experimentos com camundongos de três semanas de idade com input viral de 10³ PFU/30\03BCl no primeiro experimento e no segundo com input viral não diluído e um com camundongos neonatos com input viral de 10³ PFU/20\03BCl. Os resultados não mostraram nenhuma diferença entre os dois testes com camundongos de três semanas, entretanto com os neonatos foram neurovirulentos. Seguimos com o teste de imunogenicidade com os clones virais de YFV/DENV2 (PE) em modelo murino com input viral 104 PFU/100\03BCl. O clone YFV/DENV2C alcançou 93% de sobrevivência, YFV/DENV2A 81% e YFV/DENV2B 75%. Os resultados obtidos, são de grande importância, para a formulação de uma vacina tetravalente, a ser testada para imunogenicidade em primatas não-humanos.
Abstract: Dengue virus infection is a public health problem worldwide, with recurrent epidemics in tropical regions of Asia, Africa and the Americas. The development of vaccines against dengue is of paramount importance, since to date there are no licensed vaccines. Our ultimate intention is to be able to develop a vaccine against dengue based on recombinant yellow fever 17D vaccine virus. Recombinant viruses were constructed by exchanging structural genes prM / E of yellow fever virus by the respective genes of dengue virus serotypes 1, 2, 3, and 4. This study describes the genotypic and phenotypic characteristics of such Yellow Fever / Dengue recombinant viruses built previously. This characterization was focused on plaque size phenotype, growth in Vero cell culture in serum free medium, replication in Vero cells grown in Cell Factory (medium scale), genetic stability, clonal selection and protection against a lethal challenge in a murine model. The constructions of the recombinant viruses YFV/DENV prM/E produced viruses that replicate efficiently in stationary T-175cm ² flasks and Cell Fatory with replication and plaque morphology similar to parental wild dengue virus, suggesting that the exchange of prM/E of yellow fever virus for the same region of dengue can affect this phenotypic trait After clonal purification steps viral clones had their genome sequenced and compared with the genome of the P2 virus in the working seed lot. Some changes were observed between the amino acid sequences of passages P2 and CP2 in all clones except for clones from YFV/DENV4. Clones CP2 were further passed through eight passages in Vero cell to determine whether the virus was genetically stable. After the passages we noted that many changes were of adaptive nature to Vero cell. The clones were characterized with respect to plaque morphology as revealed by imunofocus. Clones YFV/DENV1 (PE), YFV/DENV2 (PE), YFV/DENV4 were shown to be homogeneous and YFV/DENV3 H87 was rather heterogeneous, even after cloning. Aiming to evaluate the neurotropism (attenuation) of viral clones, two experiments were conducted with three week-old mice with viral input of 10³ PFU/mouse in the first experiment and the second with undiluted viral stock. Suckling mice received a viral input of 10³ PFU/mouse. The results showed no difference between the two tests with three week-old mice, in which none of the chimeric viruses were neurovirulent. However, in suckling mice a significant degree of neurovirulence was noted. We studied the immunogenicity of the YFV/DENV2 (PE) viruses in a murine model and immunized animals challenged with an otherwise lethal dose of neurotropic DENV2 virus. Clone YFV/DENV2C provided 93% protection whereas YFV/DENV2A and YFV/DENV2B reached 81% and 75%, respectively. The results are of great importance for the development of a tetravalent vaccine.
keywords: Vírus da Febre Amarela
Dengue
Virologia
Vacinas atenuadas
Issue Date: 2013
Citation: MENDES, Luiz Gustavo Almeida. Caracterização fenotípica e molecular dos vírus quiméricos febre amarela / dengue candidatos a uma vacina tetravalente recombinante contra dengue. 2013. 108 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Imunobiológicos)-Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2013.
Date of defense: 2013
Place of defense: Rio de Janeiro
Department: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Imunobiológicos
Copyright: open access
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