Caracterização fenotípica e molecular dos vírus quiméricos febre amarela / dengue candidatos a uma vacina tetravalente recombinante contra dengue

Abstract

A infecção pelo vírus da dengue é um problema de saúde pública mundial, com epidemias recorrentes nas regiões tropicais da Ásia, África e Américas. O desenvolvimento de vacinas contra dengue é de suma importância, já que até o momento não existem vacinas licenciadas. Nossa intenção final é a de podermos desenvolver uma vacina mista recombinante contra dengue a partir do clone infeccioso do vírus da febre amarela, linhagem vacinal 17D. Isso foi realizado através da troca dos genes estruturais prM/E do vírus da febre amarela pelos respectivos genes do vírus dengue dos sorotipos 1, 2, 3, e 4. Neste trabalho descrevemos as características genotípicas e fenotípicas dos vírus recombinantes Febre Amarela/Dengue construídos anteriormente. Esta caracterização consiste em observar o comportamento desse vírus quanto ao fenótipo de placa de lise, crescimento em cultura de células Vero em meio sem soro, replicação em Cell Factory (média escala), estabilidade genética, seleção clonal, teste de neurovirulência e proteção em modelo murino. As construções dos vírus recombinantes YFV/DENV prM/E são viáveis, produzindo vírus que replicam eficientemente em garrafas estacionárias T-175cm² e Cell Fatory, com propriedades de replicação similares aos vírus dengue selvagens parentais, sugerindo que a troca da prM/E de febre amarela pela mesma região de dengue é capaz de afetar esta característica fenotípica do vírus YFV17D Após a etapa de purificação clonal os clones foram sequenciados e comparados com o lote de trabalho P2. Esta comparação revelou algumas alterações de aminoácido entre as passagens P2 e CP2 em todos os clones, exceto para os clones YFV/DENV4. Os clones CP2 foram propagados por mais oito vezes em célula Vero para determinar se os vírus eram geneticamente estáveis. Após as passagens observamos que muitas alterações foram de caráter adaptativo à célula Vero. Os clones foram caraterizados pela morfologia de placa de lise e revelados por imunofocus. Os clones YFV/DENV1 (PE), YFV/DENV2 (PE), YFV/DENV4 demonstram ser homogênios e o clone YFV/DENV3 H87 heterogêneo. Com o objetivo de avaliar o neurotropismo dos clones virais, foram realizados dois experimentos com camundongos de três semanas de idade com input viral de 10³ PFU/30\03BCl no primeiro experimento e no segundo com input viral não diluído e um com camundongos neonatos com input viral de 10³ PFU/20\03BCl. Os resultados não mostraram nenhuma diferença entre os dois testes com camundongos de três semanas, entretanto com os neonatos foram neurovirulentos. Seguimos com o teste de imunogenicidade com os clones virais de YFV/DENV2 (PE) em modelo murino com input viral 104 PFU/100\03BCl. O clone YFV/DENV2C alcançou 93% de sobrevivência, YFV/DENV2A 81% e YFV/DENV2B 75%. Os resultados obtidos, são de grande importância, para a formulação de uma vacina tetravalente, a ser testada para imunogenicidade em primatas não-humanos.