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Title: Avaliação dos anticorpos monoclonais anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8 em um teste de imunofenotipagem para a quantificação de linfócitos T, utilizando a citometria de fluxo
Advisor: Nascimento, Hilton Jorge do
Authors: Silva, Roberto Calado da
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), causada pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), é uma doença crônica sexualmente transmissível que se propaga na espécie humana. Segundo a Organização Mundial da Saúde, em 2008, cerca de 33,2 milhões de pessoas estavam infectadas pelo vírus HIV em todo o mundo e só no Brasil, atualmente, são cerca de 630 mil infectados pelo referido vírus. O principal impacto da infecção pelo HIV no sistema imune é a destruição dos linfócitos T CD4, alvo principal do vírus. Com a introdução da terapia antirretroviral, tornou-se necessário o monitoramento da resposta imunológica dos pacientes HIV+ em tratamento e assim, em 1997, foi criada a Rede Nacional de Laboratórios para a contagem das células CD4+/CD8+. Posteriormente, o Ministério da Saúde demandou para Biomanguinhos o desenvolvimento de um kit alternativo ao existente no mercado atual para a quantificação dos linfócitos T CD4+. Neste contexto, foi necessária a identificação de possíveis fornecedores para os anticorpos monoclonais a partir da produção do fluido ascítico. O objetivo do nosso trabalho foi, inicialmente, concentrar as preparações dos anticorpos monoclonais recebidos e, em seguida, analisar a homogeneidade das mesmas, conjugando-as aos fluorocromos FITC, PE, Cy5 e PECy7 A homogeneidade dos anticorpos monoclonais foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE) na presença de agente redutor, e neste experimento, foram aplicadas quantidades diferentes dos anticorpos monoclonais no suporte eletroforético. Os resultados obtidos foram concordantes e só mostraram bandas relacionadas às proteínas investigadas. Após a etapa de conjugação foram calculadas as razões molares (fluorocromo / anticorpo monoclonal) que mostraram valores adequados dentro da faixa indicativa da eficiência reacional. Para a análise citofluorimétrica foi necessário, primeiramente, se ajustar alguns parâmetros tais como volume e diluição apropriados dos anticorpos monoclonais conjugados e para este fim, analisou-se os perfis obtidos em cada tempo para as células negativas e positivas relacionadas à janela (gate) dos linfócitos. Os resultados auferidos no estudo comparativo entre os imunoconjugados fluorescentes sintetizados no Laboratório de Tecnologia Diagnóstica (LATED) de Biomanguinhos e o conjugado Tritest da empresa Becton e Dickinson (BD) deram margem à conclusão que os conjugados produzidos na Instituição nacional eram similares àqueles da empresa BD, indiferente às marcações feitas (simples, dupla e tripla) servindo como base para a análise estatística à correlação linear de Pearson.
Abstract: The Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), caused by the human immune deficiency virus (HIV), is a chronic disease sexually transmitted among human specie. According to World Health Organization (WHO), in 2008, about 33.2 million people were infected by the HIV worldwide, and only in Brazil, actually there are about 630.000 infected by the virus. The major impact of HIV on immune system is the destruction of CD4 T lymphocytes, primary target of the virus. With the introduction of the antiretroviral therapy, it became necessary the monitoring immunological response in HIV+ patients under this treatment and so, in 1997, was created the National Net of Laboratories for the counting of CD4+/CD8+ cells. Posteriorly, The Brazilian Health Department demanded for Biomanguinhos the development of an alternative kit to the existing one in the current market for the quantification of CD4+ T lymphocytes. In this context, the identification of possible suppliers for the monoclonal antibodies became necessary, from the supply of the ascitic fluid. The aim of our work was, initially, concentrate the preparations of monoclonal antibodies received, and then analyzed the homogeneity of these, combining them with the fluorochromes FITC, PE, Cy5 and PECy7 The homogeneity of the monoclonal antibodies was assessed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) containing a reductor agent. And in this experiment, were applied differents amounts of monoclonal antibodies in the electrophoretic support. The results were consistent and showed only bands related to proteins investigated. After the stage of conjugation were calculated reasons molars (fluorochromes / monoclonal antibody) that showed suitable values within the range indicative of the reaction efficiency. For the analysis cytofluorimetric was necessary, firstly, to adjust some parameters such as volume and dilution of the appropriate conjugated monoclonal antibodies and to this and, it examined the profiles obtained at each time for the negative and positive cells related to the gate of lymphocytes. The results obtained in the comparative study between fluorescent immunoconjugates synthesized in the Laboratory of Diagnostic Technology (LATED) of Biomanguinhos and the tritest conjugate of Becton e Dickinson (BD) company, gave room to conclusion that the conjugates produced in the national Institution were similar to those of the BD company, indifferent to the labels made (single, double and triple) serving as the statistical basis of Pearson linear correlation.
keywords: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
Imunofenotipagem
Anticorpos Monoclonais
Corantes Fluorescentes
Citometria de Fluxo
Issue Date: 2009
Citation: SILVA, Roberto Calado da. Avaliação dos anticorpos monoclonais anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8 em um teste de imunofenotipagem para a quantificação de linfócitos T, utilizando a citometria de fluxo. 2009. 75 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Imunobiológicos)-Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2009.
Date of defense: 2009
Place of defense: Rio de Janeiro
Department: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Imunobiológicos
Copyright: open access
Appears in Collections:Biomanguinhos - Dissertações de Mestrado

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