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Title: Desenvolvimento de Protocolo Passível de Ampliação de Escala para Propagação de Células Vero em Microcarregadores
Advisor: Pinto, Rodrigo Coelho Ventura
Souza, Marta Cristina de Oliveira
Authors: Almeida, Aline Guimarães de
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Devido à necessidade crescente de desenvolvimento de bioprocessos de produção de vacinas virais empregando linhagens de células de mamíferos e sem utilizar componentes de origem animal, bem como de estabelecimento de uma nova metodologia para a produção de uma vacina inativada contra a febre amarela, é de grande importância investigar o desenvolvimento de um novo processo, baseado na propagação do vírus amarílico em linhagens celulares cultivadas em biorreatores sob condições monitoradas e controladas que permitam uma maior reprodutibilidade, ao invés do uso de ovos embrionados. Para isso, a ampliação da escala de produção é uma etapa importante no desenvolvimento de um produto, pois deve ser executada de forma que todos os resultados obtidos em escala de laboratório possam ser reproduzidos também na escala industrial de produção prevista. No entanto, esse procedimento apresenta desafios a serem resolvidos, como, por exemplo, quando se faz o uso de microcarregadores, precisamente no procedimento de transferência celular entre microcarregadores, em escala industrial. Para esse fim, inicialmente foi avaliada a técnica de tripsinização com o objetivo de não se utilizar soro fetal bovino durante o processo de inativação da tripsina, já que foram utilizadas células Vero adaptadas ao meio sem soro, sendo, portanto, adotado o meio condicionado para inativação da tripsina Em seguida, utilizando microcarregadores, foi avaliado o perfil cinético e metabólico das células Vero, em frascos estáticos do tipo T e frascos agitados do tipo spinner. Conhecendo o perfil de crescimento, foi possível empregar a técnica de transferência bead-to-bead, utilizando agitação intermitente em diferentes intervalos de tempo. Observou-se que apenas no intervalo de 1 hora de agitação e 15 minutos de repouso houve crescimento celular significativo, tendo-se observado claramente, através de microscopia óptica invertida, o fenômeno de formação de pontes entre as células. Outra alternativa testada foi a tripsinização das células Vero nos microcarregadores, de forma que estas se soltassem e pudessem servir de inóculo tanto para os novos microcarregadores quanto para os antigos e, consequentemente, se multiplicassem. Foram testadas diferentes concentrações de soluções de tripsina, tendo-se observado que as células tripsinizadas apresentaram capacidade de aderir novamente aos microcarregadores, porém sem proliferação significativa. Para obtenção de melhores resultados, foi adicionado à etapa de tripsinização um tratamento prévio do meio de cultivo com NaOH, alcalinizando-o até que atingisse um pH entre 8 \2013 9. As células, além de mostrarem capacidade de aderir novamente aos microcarregadores, também se multiplicaram nos mesmos, indicando que a otimização da técnica torna-se válida e aplicável ne ampliação de escala do bioprocesso.
Abstract: Due to the increasing need of developing production processes for viral vaccines using mammalian cell lines in the absence of animal components, as well as a new method for the production of an inactivated vaccine against yellow fever, it is very important to develop a new process based on more controlled conditions. One way to achieve such demand is the propagation of yellow fever virus in cell lines grown in bioreactors using microcarriers and under monitored and controlled conditions in order to enable greater reproducibility. For this reason, the expansion of the production scale is an important step in the development of a product, since it must be performed in such a way that all the results obtained at laboratory scale can be reproduced at industrial scale. However, this procedure presents challenges to be faced, for instance, when using microcarriers, precisely in the cell transfer operation among microcarriers at industrial scale. For this purpose, the commonly used technique of trypsinization was evaluated aiming the removal of fetal bovine serum during the process of inactivation of trypsin, substituting it by conditioned medium, since Vero cells adapted to serum-free medium were used The metabolic and growth profile of Vero cell cultures in static T-flasks and stirred spinner flasks using microcarriers was also evaluated. Knowing the growth profile, it was possible to use the technique of bead-to-bead transfer, under intermittent stirring in different intervals. It was observed that only with 1 hour of stirring and 15 minutes of resting, there was significant growth and that bridges among cells on beads were formed, as shown by microscopic analyses. Alternatively, trypsinization of the cells on microcarriers was tested aiming the releasing of the cells and their inoculation to cultures containing new and old microcarriers. Different concentrations of trypsin were tested and it was observed that trypsinized cells showed ability to adhere to microcarriers, but without significant proliferation. For better results, a pretreatment of the medium with an alkalizing agent was added to the trypsinization step until it reached a pH between 8-9. Under these conditions the cells showed ability to adhere again to the microcarriers and to proliferate, indicating that such pretreatment is valid and applicable on a seed train strategy in microcarrier based processes.
keywords: Células Vero
Protocolos
Vacinas
Issue Date: 2013
Citation: ALMEIDA, Aline Guimarães de. Desenvolvimento de Protocolo Passível de Ampliação de Escala para Propagação de Células Vero em Microcarregadores. 2013. 89 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Imunobiológicos)-Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2013.
Date of defense: 2013
Place of defense: Rio de Janeiro
Department: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Imunobiológicos
Copyright: open access
Appears in Collections:Biomanguinhos - Dissertações de Mestrado

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