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Title: Aplicação do método de ressonância magnética nuclear para identificação e quantificação de polissacarídeos meningocócicos sorogrupos C e W135
Advisor: Silveira, Ivna Alana F. B. da
Carvalho, Érika Martins de
Authors: Leal, Ana Paula Fernandes
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Bio-Manguinhos tem sido, nos últimos anos, o único produtor brasileiro de vacinas meningocócicas que são utilizadas para o controle da doença meningocócica. Para garantir a eficácia destas vacinas, são verificados dois fatores determinantes no controle de qualidade: a pureza, dada pela concentração de ácido siálico, e a concentração de O-acetil dos polissacarídeos. O polissacarídeo meningocócico C (PSC) é constituído de ácido siálico enquanto o polissacarídeo W135 (PSW135) é constituído de ácido siálico e galactose. O método clássico utilizado no controle destas moléculas é a espectroscopia UV-Vis (Svennerholm e Hestrin), que demanda um grande número de manipulações no preparo das amostras, impactando negativamente no resultado final da análise. A espectroscopia de RMN é capaz de minimizar tal problema, possibilitando, ainda, a redução na quantidade de amostra e tempo de análise, sem a necessidade da construção de uma curva de calibração. O presente trabalho tem como objetivo a utilização de RMN de 1H para identificação e quantificação (RMNq) dos PSC e PSW135, utilizando o experimento GARP. A identidade das moléculas em estudo foi verificada através da comparação com os espectros dos padrões de ácido siálico (NANA) e galactose, para confirmação dos assinalamentos dos polissacarídeos e da escolha do sinal a ser quantificado, e com os resultados descritos na literatura Os parâmetros para a quantificação foram otimizados em função da razão sinal/ruído, e o tempo de espera foi determinado usando o método inversão-recuperação. Os parâmetros de aquisição dos espectros quantitativos foram: d1 = 25seg; ns = 64 e T = 313K. Os sinais utilizados para a quantificação do PSC foram H-7 e H-8 e região em 3,30 a 4,20ppm; e do PSW135 foi o H-3eq. A sequência GARP gerou valores de pureza e teor de OAc menores do que àqueles obtidos com a sequência padrão, mostrando a importância da remoção dos satélites 13C para a quantificação dos analitos. O método de Eletroforese Capilar foi adaptado como método alternativo de quantificação do PSW135, gerando resultados satisfatórios. Foram realizados estudos de pré-validação do método de RMNq para a quantificação do PSW135, o qual atendeu aos requisitos preconizados pela ANVISA. Os resultados obtidos pelos três métodos estudados neste trabalho apresentaram-se satisfatórios, onde ambos os polissacarídeos tem pureza acima de 80% e o PSC possui um teor de OAc acima de 1,5\03BCmol/mg. A análise estatística mostrou diferenças significativas entre os três métodos, porém todos podem ser utilizados na quantificação das moléculas. Dentre estes métodos, a RMNq apresenta vantagens pois é um método rápido e capaz de determinar a identidade, pureza e o teor de O-acetilação dos polissacarídeos em um único experimento. Em conclusão, o método proposto gera resultados satisfatórios, porém ainda necessita de pequenos ajustes para ser introduzido na rotina de controle de qualidade dos polissacarídeos meningocócicos, utilizados na produção das vacinas meningocócicas polissacarídicas e conjugadas em Bio-Manguinhos.
Abstract: Bio-Manguinhos has been, in recent years, the only producer of meningococcal vaccines that are used for the control of meningococcal disease. To ensure the effectiveness of these vaccines are checked two determining factors in quality control: the purity obtained from the concentration of sialic acid, and the concentration of O-acetyl groups. The meningococcal polysaccharide C (PSC) consists of sialic acid while polysaccharide W135 (PSW135) is composed of sialic acid and galactose. The classical method used in the quality control of these molecules is the UV-Vis spectroscopy (Svennerholm and Hestrin), which requires a large number of manipulations in the preparation of the samples, negatively impacting the final result of analysis. NMR spectroscopy is able to minimize this problem, enabling further reduction in the sample amount and analysis time without the need of building a calibration curve. This study aims the use of 1H NMR to identify and quantify (RMNq) PSC and PSW135, using GARP experiment. The identity of the molecules under study was verified by comparison with the spectra of the sialic acid (NANA) and galactose standards, to confirm the polysaccharides assignments and select the signal to be measured, and with the results described in the literature The parameters were optimized for the quantification as a function of signal/noise ratio, and delay was determined using the inversion recovery method. The acquisition parameters of quantitative spectra were: d1 = 25sec; = 64 ns and T = 313K. The signals used for measurement of PSC were H-7 and H-8 and 3.30 to 4.20 ppm region, and for PSW135 was H-3eq. The GARP sequence generated values of purity and OAc content lower than those obtained with the standard sequence, showing the importance of the removal of satellites 13C for quantification of the analytes. The capillary electrophoresis method was adapted as an alternative method to quantify PSW135, producing satisfactory results. Prevalidation studies were performed for quantification of PSW135 using the qNMR method, which attended the recommended requirements by ANVISA. The results obtained by the three methods were satisfactory, where both polysaccharides have purity above 80% and the PSC has a content of OAC above 1.5 \03BCmol/mg. Statistical analysis showed significant differences among three methods, but all can be used in the molecules quantification. Among these methods, the qNMR is advantageous because it is a quick method and be able to determine the identity, purity and degree of polysaccharide O-acetylation in a single experiment. In conclusion, the proposed method generates satisfactory results, but still needs minor adjustments to be introduced into the routine quality control of meningococcal polysaccharides used in the production of polysaccharide and conjugate meningococcal vaccines in Bio-Manguinhos.
keywords: Polissacarídeos
Espectroscopia de Ressonância Magnética
Eletroforese Capilar
Spectrofotometria Ultravioleta
Issue Date: 2013
Citation: LEAL, Ana Paula Fernandes. Aplicação do método de ressonância magnética nuclear para identificação e quantificação de polissacarídeos meningocócicos sorogrupos C e W135. 2013. 122 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Imunobiológicos)-Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2013.
Date of defense: 2013
Place of defense: Rio de Janeiro
Department: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Imunobiológicos
Copyright: open access
Appears in Collections:Biomanguinhos - Dissertações de Mestrado

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