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Title: Otimização e validação do método de determinação do conteúdo de polissacarídeo na vacina Haemophilus influenzae b (conjugada) por cromatografia a líquido de alta eficiência por troca aniônica
Advisor: Albert, André Luis Mazzei
Authors: Santos, Anelyse de Carvalho Lira
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é uma bactéria patogênica responsável por causar pneumonia e meningite, principalmente em crianças menores de cinco anos. A doença causada por Hib pode ser prevenida através da imunização da população com a vacina conjugada polissacarídeo-proteína, cuja eficácia depende do principal fator de virulência da bactéria: a cápsula polissacarídica. Assim, para garantir a imunogenicidade da vacina, é importante o controle do conteúdo de polissacarídeo presente no produto final. O objetivo deste trabalho foi otimizar e validar o método analítico, desenvolvido pelo Departamento de Controle de Qualidade de Bio-Manguinhos, de determinação do conteúdo de polissacarídeo na vacina conjugada de Hib, empregando a técnica de cromatografia a líquido de alta eficiência por troca aniônica com detecção amperométrica pulsada. O método cromatográfico foi otimizado quanto à retenção e resolução adequadas. A mudança na waveform de trabalho promoveu maior sensibilidade, reprodutibilidade e menos desgaste do eletrodo de trabalho. A alteração da composição da fase móvel permitiu boa separação, com alta sensibilidade, reduzindo o tempo de corrida de 17 para 12 minutos. O tempo necessário para o pré-tratamento das amostras (hidrólise alcalina) foi reduzido de 7 horas para 40 minutos. Os parâmetros cromatográficos estabelecidos na otimização do método foram: coluna analítica CarboPac PA10 (4 x 250 mm) precedida por pré-colunas AminoTrap (3 x 30 mm) e BorateTrap (4 x 50 mm), da Dionex Corporation Foi empregado um fluxo de 1 mL/min, com eluição isocrática. A fase móvel foi composta de solução de acetato de sódio 0,2 mmol/L e solução de hidróxido de sódio 0,7 mol/L. O volume de injeção foi de 50 \03BCL. Os parâmetros de adequação do sistema da nova metodologia estão em conformidade com os preconizados nos compêndios oficiais no que concerne à validação de metodologias analíticas. O método demonstrou boa seletividade, bem como apresentou linearidade ao longo do intervalo de medição estudado, com limites de detecção e quantificação iguais a, respectivamente, 0,56 \03BCg/mL e 1,66 \03BCg/mL. A precisão do método pode ser considerada satisfatória, em termos dos coeficientes de variação obtidos, inferiores a 5 %, conforme preconiza a ANVISA. Não foi evidenciada diferença significativa entre os resultados apresentados por analistas diferentes em dias diferentes. A recuperação média obtida foi de (100 ± 2) %, demonstrando que o método apresenta exatidão adequada. Com relação à robustez, foi constatada a susceptibilidade do método a variações no pH da fase móvel e ao tempo de hidrólise. A validação do método produziu dados adequados para garantir a confiabilidade dos resultados analíticos obtidos e para o emprego da metodologia proposta no controle de qualidade do produto final, realizado pelo Laboratório Físico-Químico, do Departamento de Controle de Qualidade de Bio-Manguinhos.
Abstract: Haemophilus influenzae type b (Hib) is a pathogenic bacterium responsible for causing pneumonia and meningitis, especially in children aged less than 5 years. The disease caused by Hib can be prevented by immunization of the population with the polysaccharide-protein conjugate vaccine, whose effectiveness depends on the major virulence factor of the bacterium: a polysaccharide capsule. Thus, to ensure vaccine immunogenicity, it is important to control the content of polysaccharide present in the final product. The aim of this study was to optimize and validate the analytical method, developed by the Quality Control Department of Bio-Manguinhos, in order to determine the content of the polysaccharide in the conjugate vaccine of Hib, using the technique of liquid chromatography high performance anion exchange with pulsed amperometric detection. The chromatographic method was optimized for retention and appropriate resolution. The change in working waveform promoted greater sensitivity, reproducibility and less wear on the working electrode. The changing composition of the mobile phase enabled good separation with high sensitivity, reducing the running time from 17 to 12 minutes. The time required for the pretreatment of samples (alkaline hydrolysis) was reduced from 7 hours to 40 minutes The chromatographic parameters established in the optimized method were CarboPac PA10 (4 x 250 mm) analytical column, preceded by AminoTrap (3 x 30 mm) and BorateTrap (4 x 50 mm) pre-columns, from Dionex Corporation. A flow rate of 1 mL/min with isocratic elution was employed. The mobile phase consisted of 0.2 mmol/L sodium acetate solution and 0.7 mol/L sodium hydroxide solution. The injection volume was 50 \03BCL. System suitability parameters of the new methodology are in line with those recommended in the official compendia concerning validation of analytical methodologies. The method has shown good selectivity as well, showed linearity over the studied measuring interval, with limits of detection and quantification equal to, respectively, 0,56 \03BCg/mL and 1,66 \03BCg/mL. Method accuracy can be considered satisfactory in terms of coefficient of variation obtained, lower than 5 %, as required by ANVISA. There was no significant difference between results reported by different analysts, on different days. Average recovery was (100 ± 2) %, demonstrating that the method has adequate accuracy. In relation to robustness, the method was found susceptible to pH of the mobile phase variations and to hydrolysis time. The method validation yielded adequate results to ensure reliability of the analytical results and the employment of the proposed methodology in quality control of the final product, conducted by the Physicochemical Laboratory from the Department of Quality Control of Bio-Manguinhos.
keywords: Haemophilus Influenzae Tipo B
Controle de Qualidade
Cromatografia Líquida
DeCS: Vacinas Conjugadas
Issue Date: 2013
Citation: SANTOS, Anelyse de Carvalho Lira. Otimização e validação do método de determinação do conteúdo de polissacarídeo na vacina Haemophilus influenzae b (conjugada) por cromatografia a líquido de alta eficiência por troca aniônica. 2013. 98 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Imunobiológicos)-Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2013.
Date of defense: 2013
Place of defense: Rio de Janeiro
Department: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Imunobiológicos
Copyright: open access
Appears in Collections:Biomanguinhos - Dissertações de Mestrado

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