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Title: Avaliação de testes moleculares para detecção e quantificação do vírus da hepatite B utilizando amostras de soro e fluido oral
Advisor: Villar, Lívia Melo
Members of the board: Araújo, Natalia Motta de
Guimarães, Monick Lindenmeyer
Baptista, Patrícia Alvarez da Silva
Foti, Leonardo
Moreira, Otacílio da Cruz
Authors: Portilho, Moyra Machado
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: INTRODUÇÃO: A detecção e/ou quantificação do DNA do vírus da hepatite B (HBV) é útil para caracterizar a infecção, definir o início do tratamento antiviral, monitorar o curso clínico da infecção e demonstrar o efeito dos medicamentos na replicação do HBV. No entanto, precisam ser realizadas utilizando-se métodos sensíveis para um diagnóstico precoce e detecção de baixas cargas virais, como nos casos de hepatite B oculta. Os métodos comerciais tem custo alto para países em desenvolvimento como o Brasil. Dessa forma, é importante a avaliação de metodologias in-house com boa sensibilidade, fácil execução e baixo custo. Além disso, o uso de amostras de fluido oral é interessante para indivíduos com acesso venoso difícil, como crianças, usuários de drogas intravenosas e hemodialisados. OBJETIVO: Esse estudo tem como objetivo otimizar métodos moleculares para detecção e quantificação do HBV DNA em amostras de soro e fluido oral. METODOLOGIA. Foram conduzidos quatro trabalhos: No primeiro estudo, foram incluídos 228 amostras de soro de indivíduos com hepatite B subdivididos em 3 grupos para avaliação de 3 métodos qualitativos in-house. No segundo trabalho, 74 indivíduos (32 HBsAg reagentes e 42 sem nenhum marcador de hepatite B) forneceram amostras de soro e fluido oral obtidas por quatro diferentes métodos (Salivette, FTA Card, cuspe e DNA-Sal), para determinação do coletor mais apropriado para detecção qualitativa do HBV DNA. No terceiro estudo, 45 indivíduos com HBsAg não reagente, anti-HBc reagente e anti-HBs não reagente forneceram amostras de soro e fluido oral para detecção do HBV DNA para identificação de hepatite B oculta E no quarto trabalho, 103 indivíduos (55 HBsAg reagentes e 48 sem nenhum marcador para hepatite B) forneceram amostras de soro e fluido oral para a avaliação de um método de PCR em tempo real in-house que utiliza uma curva padrão sintética. RESULTADOS. No primeiro estudo, a semi-nested PCR para amplificação do gene S do HBV apresentou os melhores resultados entre os métodos qualitativos em comparação aos testes comerciais (Cobas Amplicor HBV Monitor e Cobas TaqMan HBV, Roche Diagnostics). No segundo estudo, o HBV DNA foi detectado em fluido oral coletado por 4 técnicas distintas, com maior sensibilidade do dispositivo Salivette, seguido pelo FTA Card, cuspe e DNA-Sal. Houve maior detecção do HBV em fluido oral cujas respectivas amostras de soro possuem carga viral elevada. No terceiro estudo, o HBV DNA foi detectado em cinco amostras de soro e em quatro amostras de fluido oral dos indivíduos anti- HBc reagentes (o limite de detecção de fluido oral foi de 1,656 log UI/mL no soro pareado). No quarto trabalho, o método de PCR em tempo real com curva sintética desenvolvido apresentou 85% de concordância com o teste comercial usando amostras de soro, e foi possível detectar o HBV DNA em amostras de fluido oral. CONCLUSÕES. As metodologias in-house qualitativas e quantitativas avaliadas nesse estudo podem ser alternativas para a triagem inicial de amostras em laboratórios com poucos recursos financeiros. O coletor Salivette foi determinado como o mais eficiente para detecção do HBV DNA principalmente quando as respectivas amostras de soro possuem alta carga viral como também de pacientes com hepatite B oculta. Dessa forma, este tipo de amostra poderia ser útil para detecção do HBV DNA em determinados grupos como para identificação de casos de hepatite B oculta, podendo ser utilizado como alternativa à coleta de sangue em pacientes com acesso venoso difícil
Abstract: INTRODUCTION: The detection and/or quantification of the hepatitis B virus (HBV) DNA is useful to characterize the infection, to define the beginning of antiviral treatment, to monitor the clinical course of the infection and to demonstrate the effect of the drugs on HBV replication. However, they need to be performed using sensitive methods for early diagnosis and detection of low viral loads, such as in cases of occult hepatitis B. The commercial methods have a high cost for developing countries such as Brazil. Thus, it is important to evaluate in-house methodologies with good sensitivity, easy execution and low cost. In addition, investigating oral fluid samples is interesting for individuals with limited venous access, such as children, intravenous drug users and hemodialysis. OBJECTIVE: This study aims to optimize molecular methods for the detection and quantification of HBV DNA in serum and oral fluid samples. METHODOLOGY: Four studies were conducted: First, 228 patients were subdivided into three groups for the evaluation of three qualitative in-house methods. In the second study, 74 individuals (32 HBsAg reagents and 42 without any hepatitis B marker) provided serum and oral fluid samples obtained by four different methods (Salivette, FTA Card, spitting and DNA-Sal) to determine the most appropriate collector. In third study, 45 subjects with HBsAg negative, anti- HBc positive and anti-HBs negative provided serum and oral fluid samples for detection of HBV DNA for identification of occult hepatitis B. Fourth, 103 subjects (55 HBsAg reagents and 48 without any hepatitis B marker) provided serum and oral fluid samples for the evaluation of an in-house real time PCR method using a synthetic standard curve RESULTS: In the first study, the semi-nested PCR for amplification of the S gene region showed the best results among the qualitative methods compared to the commercial tests (Cobas Amplicor HBV Monitor and Cobas TaqMan HBV). In the second study, HBV DNA was detected in oral fluid collected by 4 distinct techniques, with greater sensitivity of Salivette, followed by FTA Card, spitting and DNASal. There was a greater detection of HBV in oral fluids whose respective serum samples had high viral load. In the third study, HBV DNA was detected in five serum samples and in four oral fluid samples from anti-HBc reagent subjects (oral fluid detection limit was 1.656 log IU/mL in paired serum). Finally, the real time PCR method with synthetic curve presented 85% agreement with the commercial test using serum samples, and it was also possible to detect HBV DNA in oral fluid samples. CONCLUSIONS: The qualitative and quantitative in-house methodologies evaluated in this study may be alternatives for the initial screening of samples in laboratories with few financial resources. The Salivette specimen was determined to be the best for detection of HBV DNA mainly when the respective serum samples have high viral load as well as for patients with occult hepatitis B. Thus, this type of sample could be useful for HBV DNA detection in certain groups such as in cases of occult hepatitis B, and could be used as an alternative to blood collection in patients with difficult venous access
keywords: Hepatite B
Diagnóstico
Saliva
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Estrutura Molecular
DeCS: Hepatite B
Diagnóstico
Saliva
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Estrutura Molecular
Issue Date: 2017
Citation: PORTILHO, Moyra Machado. Avaliação de testes moleculares para detecção e quantificação do vírus da hepatite B utilizando amostras de soro e fluido oral. 2017. 152 f. Tese (Doutorado em Medicina Tropical)-Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2017.
Date of defense: 2017
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Medicina Tropical
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
Copyright: restricted access
Appears in Collections:IOC - PGMT - Teses de Doutorado

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