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Title: Desenvolvimento de metodologias para purificação e caracterização da proteína recombinante LigANI candidata a vacina contra Leptospirose humana e animal
Advisor: Medeiros, Marco Alberto
Authors: Esteves, Gabriela dos Santos
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: A leptospirose é uma das zoonoses mais difundidas pelo mundo de acordo com a OMS. No Brasil, nos últimos 10 anos foram notificados 42.891 casos e 3.762 foram a óbito. Os casos de leptospirose vêm aumentando ao longo dos anos e nesse sentido, nosso grupo vem trabalhando com as proteínas da família Lig (Leptospiral immunoglobulin-like) visando sua utilização como ferramenta para diagnóstico e como candidatas ao desenvolvimento de uma vacina de subunidade recombinante. Em 2007, nosso grupo demonstrou o potencial da região não idêntica de LigA (LigANI) como candidata vacinal, já que foi capaz de proteger 67-100% dos animais contra desafio letal. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi otimizar a expressão em cultivo de alta densidade e estabelecer as metodologias para obtenção da proteína recombinante LigANI com alto grau de pureza e homogeneidade e além disso, determinar as características físico-químicas e biológicas da proteína LigANI, uma vez que estas informações são fundamentais para o desenvolvimento de um produto com aplicação bioterapêutica Para tal, realizamos o aumento de escala em biorreator de 80 mL para 2 litros de cultivo e obtivemos 1058 mg de LigANI/L de cultivo. A proteína foi purificada utilizando três passos de cromatografia: afinidade por íons metálicos (IMAC), gel filtração (GF) e troca iônica (IEX) e o rendimento total do processo foi de 219,52 mg de LigANI/litro de cultivo com uma pureza de 99,70 ± 0,24%. Os dados experimentais confirmaram a massa molecular de 66,9 kDa, ponto isoelétrico de 6,94 e estrutura secundária composta predominante por folha \03B2. A proteína LigANI demonstrou a capacidade de aderir a diferentes proteínas de matriz extracelular e ser antigênica frente a soros de pacientes com leptospirose. Além disso, foi demonstrada a reatividade cruzada entre a proteína LigANI de Leptospiras patogênicas de diferentes sorovares a partir de soro hiperimune anti-LigANI de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni. Os dados de estabilidade demonstraram que a proteína se manteve estável por 120 dias quando armazenada a -80ºC e liofilizada por 120 dias. Diante do conjunto de dados, demonstramos a viabilidade técnica do uso da proteína LigANI como uma candidata no desenvolvimento de uma vacina contra Leptospirose humana e veterinária.
Abstract: Leptospirosis is one of the most common zoonoses in the world according to WHO and the number of leptospirosis cases have been increasing over the years. In Brazil, 42,891 cases have been reported in the last 10 years, and 3,762 have died. Our group has been working with Leptospiral immunoglobulin-like proteins as diagnostic and subunit vaccine candidate and in 2007, we demonstrated the potential of the non- identical LigA region (LigANI) as a vaccine candidate, as it was able to protect 67- 100% of the animals against lethal challenge. Thus, the aim of this work was to establish the methodologies to obtain the recombinant LigANI protein with a high degree of purity and homogeneity and to determine the physico-chemical and biological characteristics of the LigANI protein, since these informations are essencial for the development of a product with biotherapeutic application So, we performed the scale up from 80 mL bioreactor to 2 liters of culture and obtained 1058 mg of LigANI per liter of culture. The protein was purified using three chromatographic steps: immobilized metal affinity chromatography (IMAC), gel filtration (GF) and ion exchange (IEX) and the total yield of the process was 219.52 mg of LigANI per liter of culture with a purity of 99.70 ± 0.24%. The experimental data confirmed the molecular mass of 66.9 kDa, isoelectric point of 6.94 and secondary structure formed mostly by \03B2 sheet structure. The LigANI protein bound to different extracellular matrix proteins and was antigenic against sera from patients with leptospirosis. It also demonstrated cross- reactivity with of other pathogenic Leptospiras as hyperimmune serum of anti-LigANI of Leptospira interrogans serovar Copenhageni recognized LigANI from different serovars. Stability data showed that the protein remained stable when stored at -80°C and lyophilized for 120 days. In summary, we demonstrated the technical feasibility of LigANI protein as a candidate in the development of a vaccine against human and veterinary Leptospirosis.
keywords: Proteínas Recombinantes
Leptospirose
Vacinas isolamento & purificação
Bioquímica
Prevenção e Controle
Issue Date: 2018
Citation: ESTEVES, Gabriela dos Santos. Desenvolvimento de metodologias para purificação e caracterização da proteína recombinante LigANI candidata a vacina contra Leptospirose humana e animal. 2018. 175 f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular)-Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Rio de Janeiro
Department: Instituto Oswaldo Cruz
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Teses de Doutorado

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