Desenvolvimento de metodologias para purificação e caracterização da proteína recombinante LigANI candidata a vacina contra Leptospirose humana e animal

Abstract

A leptospirose é uma das zoonoses mais difundidas pelo mundo de acordo com a OMS. No Brasil, nos últimos 10 anos foram notificados 42.891 casos e 3.762 foram a óbito. Os casos de leptospirose vêm aumentando ao longo dos anos e nesse sentido, nosso grupo vem trabalhando com as proteínas da família Lig (Leptospiral immunoglobulin-like) visando sua utilização como ferramenta para diagnóstico e como candidatas ao desenvolvimento de uma vacina de subunidade recombinante. Em 2007, nosso grupo demonstrou o potencial da região não idêntica de LigA (LigANI) como candidata vacinal, já que foi capaz de proteger 67-100% dos animais contra desafio letal. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi otimizar a expressão em cultivo de alta densidade e estabelecer as metodologias para obtenção da proteína recombinante LigANI com alto grau de pureza e homogeneidade e além disso, determinar as características físico-químicas e biológicas da proteína LigANI, uma vez que estas informações são fundamentais para o desenvolvimento de um produto com aplicação bioterapêutica Para tal, realizamos o aumento de escala em biorreator de 80 mL para 2 litros de cultivo e obtivemos 1058 mg de LigANI/L de cultivo. A proteína foi purificada utilizando três passos de cromatografia: afinidade por íons metálicos (IMAC), gel filtração (GF) e troca iônica (IEX) e o rendimento total do processo foi de 219,52 mg de LigANI/litro de cultivo com uma pureza de 99,70 ± 0,24%. Os dados experimentais confirmaram a massa molecular de 66,9 kDa, ponto isoelétrico de 6,94 e estrutura secundária composta predominante por folha \03B2. A proteína LigANI demonstrou a capacidade de aderir a diferentes proteínas de matriz extracelular e ser antigênica frente a soros de pacientes com leptospirose. Além disso, foi demonstrada a reatividade cruzada entre a proteína LigANI de Leptospiras patogênicas de diferentes sorovares a partir de soro hiperimune anti-LigANI de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni. Os dados de estabilidade demonstraram que a proteína se manteve estável por 120 dias quando armazenada a -80ºC e liofilizada por 120 dias. Diante do conjunto de dados, demonstramos a viabilidade técnica do uso da proteína LigANI como uma candidata no desenvolvimento de uma vacina contra Leptospirose humana e veterinária.