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Title: Efeito da exposição de Giardia duodenalis ao metronidazol nas sequências gênicas associadas à resistência ao fármaco
Advisor: Cruz, Alda Maria da
Authors: Oliveira, Luiz Antonio Pimentel Lopes de
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: A giardiase é uma doença infecciosa, que tem uma incidência estimada em 280 milhões de casos, acometendo principalmente países em desenvolvimento. Os fármacos de primeira escolha para o tratamento da infecção por Giardia duodenalis pertencem à classe dos 5-nitroimidazóis, principalmente o metronidazol. De forma alarmante, casos de falha terapêutica após o tratamento com essa classe de fármacos têm sido cada vez mais frequentes. Embora fatores como utilização inadequada do fármaco, reinfecções e imunossupressão possam estar envolvidos, o surgimento de resistência de G. duodenalis é uma hipótese que deve ser investigada, principalmente, já que há um uso indiscriminado de medicamentos antimicrobianos pela população. As proteínas piruvato-ferredoxina oxidorredutase (PFOR) e ferredoxina (FD) participam da principal via de metabolização do metronidazol a sua forma biologicamente ativa. Além disso, enzimas como a glutamato desidrogenase (GDH) têm sido indiretamente vinculadas à resistência de G. duodenalis ao metronidazol. Portanto, alterações nos genes que codificam essas proteínas podem tornar o parasito resistente ao farmaco O objetivo do estudo foi avaliar se a exposição in vitro de G. duodenalis ao metronidazol leva a alterações nucleotídicas em fragmentos gênicos associados à redução da susceptibilidade ao fármaco. Para tal, cultivos de trofozoítos de G. duodenalis (WBATCC50803) foram divididos em 6 grupos: 4 grupos expostos ao metronidazol nas concentrações de 5\03BCM, 10\03BCM, 20\03BCM e 80\03BCM denominados MTZ5, MTZ10, MTZ20 e MTZ80, respectivamente; e 2 controles, um sem exposição ao metronidazol (SMTZ) e outro exposto ao dimetilsulfóxido (CDMSO), e cultivados num período de 16 semanas. Posteriormente, a concentração necessária para inibir 50% do crescimento parasitário (IC50) foi determinada utilizando o método colorimétrico da resazurina. A padronização da reação em cadeia da polimerase e o sequenciamento de fragmentos gênicos (pfor, fd e gdh), que potencialmente poderiam estar associados à resistência, foram realizados em todos os grupos. O valor da IC50 dos grupos foi: SMTZ = 2,26 ± 0,3 \03BCM; CDMSO = 2,02 ± 0,3 \03BCM; MTZ5 = 4,3 ± 0,6 \03BCM; MTZ10 = 5,07 ± 0,7 \03BCM; MTZ20 = 7,09 ± 0,8 \03BCM; não foi possível determinar a IC50 do grupo MTZ80. Os grupos expostos ao metronidazol apresentaram um aumento significativo da IC50 em comparação aos controles. Entretanto, não foram encontradas as alterações nucleotídicas nos genes de pfor, fd e gdh, que classicamente vêm sendo associadas à resistência ao metronidazol. Esses resultados indicam que outros mecanismos genéticos ou bioquímicos devem também estar envolvidos na resistência de G. duodenalis aos 5-nitroimidazóis
Abstract: Giardiasis is an infectious disease, which has an estimated incidence of 280 million, affecting mainly developing countries. The first choice drugs for treatment of Giardia duodenalis infection belong to the class of 5-nitroimidazoles, mainly metronidazole. Alarmingly, cases of treatment failure following treatment with this drugs class have been increasingly frequent. Although factors such as inadequate use of the drug, reinfections and immunosuppression may be involved, the emergence of G. duodenalis resistance is a hypothesis that should be investigated, mainly due to the indiscriminate use of antimicrobial drugs by the population. The pyruvate-ferredoxin oxidoreductase (PFOR) and ferredoxin (FD) proteins participate in the main route of metronidazole metabolization to its biologically active form. In addition, enzymes such as glutamate dehydrogenase (GDH) have been indirectly linked to resistance of G. duodenalis to metronidazole. Therefore, changes in the genes encoding these proteins may cause resistance in the parasite. The aim of the study was to evaluate if the in vitro exposure of G. duodenalis to metronidazole leads to nucleotide changes in gene fragments associated with reduced susceptibility to the drug For this, G. duodenalis trophozoites (WBATCC50803) were cultured in six groups: four groups exposed to metronidazole, named MTZ5, MTZ10, MTZ20 and MTZ80, at concentrations of 5 \03BCM, 10 \03BCM, 20 \03BCM and 80 \03BCM of the drug, respectively; and two controls, called SMTZ (without exposure to metronidazole) and CDMSO (exposed to dimethylsulfoxide), and cultured over a 16 week period. Subsequently, the concentration required to inhibit 50% parasitic growth was determined using the colorimetric method of resazurin. Standardization of the polymerase chain reaction and the sequencing of gene fragments (pfor, fd and gdh) that could potentially be associated with resistance were performed in all groups. The IC50 value of the groups was: SMTZ = 2.26 ± 0.3 \03BCM; CDMSO = 2.02 ± 0.3 \03BCM; MTZ5 = 4.3 ± 0.6 \03BCM; MTZ 10 = 5.07 ± 0.7 \03BCM; MTZ20 = 7.09 ± 0.8 \03BCM; it was not possible to determine the IC50 of the MTZ80 group. Groups exposed to metronidazole showed a significant increase in IC50 compared to controls. However, although we observed a decrease in drug susceptibility, no nucleotide changes were found in the pfor, fd and gdh genes that have been associated with resistance to metronidazole. These results indicate that other genetic or biochemical mechanisms may be involved in the resistance of G. duodenalis to 5-nitroimidazoles.
keywords: Giardiase
Metronidazol
Resistência a Medicamentos
Issue Date: 2017
Citation: OLIVEIRA, Luiz Antonio Pimentel Lopes de. Efeito da exposição de Giardia duodenalis ao metronidazol nas sequências gênicas associadas à resistência ao fármaco. 2017. 58 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária)-Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2017.
Date of defense: 2017
Place of defense: Rio de Janeiro
Department: Instituto Oswaldo Cruz
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBP - Dissertações de Mestrado

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