Please use this identifier to cite or link to this item: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/27911
Title: Comparação de métodos moleculares aplicados ao complexo Candida parapsilosis
Advisor: Oliveira, Rosely Maria Zancope
Muniz, Mauro de Medeiros
Authors: Barbedo, Leonardo Silva
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Dentre as espécies de Candida não-albicans, Candida parapsilosis emergiu nas últimas décadas em todo o globo como relevante patógeno nosocomial em infecções fúngicas invasivas com disseminação hematogênica. Em alguns hospitais, C. parapsilosis tem se tornado a espécie predominante em candidemias, e a mais frequente em fungemias em adultos e recém-nascidos com o uso frequente de cateteres e nutrição parenteral. Desde 2005, baseado na técnica de tipagem por sequenciamento de multilocus (MLST), C. parapsilosis é considerado um complexo de leveduras formado por três diferentes espécies, onde C. parapsilosis lato sensu inclui as espécies Candida parapsilosis stricto sensu, Candida orthopsilosis e Candida metapsilosis. Até o presente, só é possível distinguir essas três espécies por técnicas de biologia molecular. Com isso, o objetivo deste trabalho foi comparar o sequenciamento da região D1/D2 da sub-unidade maior 28S do gene do DNA ribossomal (rDNA), com a PCR utilizando primers espécie-específios, a PCR-RFLP da região ITS1-5.8S-ITS2 e a análise de microsatélites (CP1, CP4a, CP6 e B), com a finalidade de se estabelecer uma identificação correta dos isolados de C. parapsilosis lato sensu. Um total de 100 isolados, oriundos de amostras de sangue e cateter, obtidos de pacientes de três hospitais no município do Rio de Janeiro, entre 1998 e 2006, associados a episódios de fungemia, foram analisados. O sequenciamento da região D1/D2 revelou 61 isolados de C. parapsilosis stricto sensu, 37 de C. orthopsilosis e 2 de C. metapsilosis. A PCR espécie-específica e a PCRRFLP mostraram 59 isolados de C. parapsilosis stricto sensu, 39 de C. orthopsilosis e 2 de C. metapsilosis A técnica de tipagem pelos microsatélites revelou 58 isolados de C. parapsilosis stricto sensu que amplificaram para os quatro marcadores, enquanto que três isolados não amplificaram apenas para o marcador CP4a, mas foram considerados como C. parapsilosis stricto sensu por amplificarem para os marcadores CP1, CP6 e B. Assim, o coeficiente Kappa entre a PCR espécie-específica ou a PCR-RFLP com o sequenciamento da região D1/D2 foi de 0,96; enquanto que o coeficiente para a metodologia dos microsatélites com o sequenciamento da região D1/D2, para os isolados de C. parapsilosis stricto sensu, encontramos Kappa = 1. Em dois pacientes identificamos C. parapsilosis stricto sensu oriunda do cateter e C. orthopsilosis oriunda do sangue, porém ambas coletadas no mesmo dia, assim, revelando infecção polifúngica. A metodologia dos microsatélites identificou 39 genótipos em multilocus, mostrando que nos 61 isolados de C. parapsilosis stricto sensu havia estirpes idênticas, diferentes e casos de microvariação. Nos casos de estirpes idênticas, encontramos duas situações: (i) isolados provenientes do mesmo paciente coletados com menos de três meses de diferença, sugerindo uma manutenção da estirpe e; (ii) isolados coletados tanto da amostra de sangue quanto de cateter do mesmo paciente, na mesma data, demonstrando que o cateter poderia ser a provável origem da infecção sistêmica. Já nos casos de presença de estirpes distintas, isoladas de um mesmo paciente, coletadas com mais de três meses de diferença, sugere uma substituição da estirpe Por fim, nos casos de microvariação, encontramos em isolados do mesmo paciente coletados no mesmo momento, em ambas amostras (sangue e cateter) pontuando de maneira contundente, pela robustez da metodologia empregada (microsatélites), microevolução em tais isolados. Este estudo reforça a importância da correta identificação de espécies, dos cuidados na manipulação do cateter, e da constante vigilância e monitoramento do ambiente hospitalar para identificar possíveis permanências de estirpes e suas rotas de transmissão
Abstract: Among non-albicans Candida species, Candida parapsilosis have emerged in recent decades across the globe as an important nosocomial pathogen in invasive fungal infections with hematogenous dissemination. In some hospitals, C. parapsilosis has become the predominant species in candidemias, and the most frequent agent of fungemia in adults and newborns in use of catheters and parenteral nutrition. Since 2005, based on the multilocus sequence typing (MLST), C. parapsilosis is considered a complex consisting of three different yeast species, where C. parapsilosis sensu lato includes the species Candida parapsilosis sensu stricto, Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis. So far, it is only possible to distinguish these three species by molecular techniques. Thus, the aim of this study was to compare the sequencing of the D1/D2 region of the large subunit of the 28S ribosomal DNA (rDNA) gene, with the PCR using species-specific primers, the PCR-RFLP of the region ITS1-5.8S-ITS2 and the microsatellites (CP1, CP4a, CP6 and B) analysis, in order to establish a correct identification of C. parapsilosis sensu lato isolates. A total of 100 isolates, from catheter and blood samples, obtained from patients in three hospitals in the city of Rio de Janeiro between 1998 and 2006, associated with episodes of fungemia, were analyzed. The sequencing revealed 61 C. parapsilosis sensu stricto isolates, 37 C. orthopsilosis and 2 C. metapsilosis. The species-specific PCR and the PCR-RFLP showed 59 C. parapsilosis sensu stricto isolates, 39 C. orthopsilosis and 2 C. metapsilosis. The microsatellite typing technique revealed 58 C. parapsilosis sensu stricto isolates that amplified for all markers, while three isolates did not amplify for CP4a marker, but were considered C. parapsilosis sensu stricto by amplifying for CP1, CP6 and B markers Thus, the Kappa coefficient between speciesspecific PCR or PCR-RFLP with the sequencing of the D1/D2 region was 0,96; while the coefficient for microsatellites with the sequencing of the D1/D2 region, to C. parapsilosis sensu stricto isolates, was Kappa = 1. In two patients we identified C. parapsilosis sensu stricto from catheter and C. orthopsilosis from blood, both collected on the same day, revealing polyfungal infections. Microsatellite markers identified 39 multilocus genotypes, showing that the 61 C. parapsilosis sensu stricto isolates were identical, different and microvariations strains. In cases of identical strains, we found two situations: (i) isolates from the same patient collected at least three months apart, suggesting maintenance of the strain; (ii) isolates collected on the same day for the blood and catheter samples from the same patient, demonstrating that the catheter could be the likely source of systemic infection. On the other hand, in cases of distinct strains, isolates from the same patient, collected with more than three months apart, suggesting replacement of the strain. Finally, in the microvariations cases, we found isolates from the same patient collected on the same time, in both samples (blood and catheter) pointing a blow to, the robustness of the methodology employed (microsatellites), microevolution in such isolates. This study reinforces the importance of correct species identification, care in catheter manipulation, and constant surveillance and hospital environment monitoring to identify possible permanence of strains and their transmission routes
keywords: Candida
DeCS: Candidemia
Técnicas De Tipagem Micológica
Issue Date: 2015
Citation: BARBEDO, Leonardo Silva. Comparação de métodos moleculares aplicados ao complexo Candida parapsilosis. 2015. 181f. Tese (Doutorado em pesquisa clínica em doenças infecciosas)-Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2015.
Date of defense: 2015
Place of defense: Rio de Janeiro
Department: Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas
Copyright: open access
Appears in Collections:INI - PCDI - Teses de Doutorado

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
leonardo_barbedo_ini_dout_2015.pdf5.75 MBAdobe PDFView/Open


FacebookTwitterDeliciousLinkedInGoogle BookmarksBibTex Format mendeley Endnote DiggMySpace

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.